$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
다음 프로토콜은 Davies et al, Caenorhabditis elegans의 운동 속도에 대한 에탄올의 영향을 측정하기 위한 분석, J. Vis. Exp. (2015).
-
분석 전날에 수행할 단계
- L4 단계 지렁이를 OP50 E. coli 잔디밭에 파종한 신선한 선충 성장 배지(NGM) 플레이트로 선택하고 20°C O/N에서 배양합니다. 각 분석 조건에는 10개의 웜이 필요합니다. 웜의 O/N 손실을 허용하기 위해 과도한 웜을 선택하십시오.
- 오직 첫날 성체인 동물만을 분석한다; 많은 돌연변이체들은 야생형보다 느린 속도로 성장한다. 발달 지연이 있는 균주에 대한 채취 시기를 조정하여 테스트된 모든 동물이 첫날 성인이 되도록 합니다.
- 분석 당일에 수행할 단계
- 분석 준비:
- 시드되지 않은 표준 60 x 15mm NGM 플레이트에서 분석을 수행합니다. 뚜껑을 연 상태에서 37°C에서 사용할 모든 플레이트를 2시간 동안 건조시킵니다. 각 실험 시험에 대해 4개의 건조된 NGM 플레이트를 사용합니다. 이는 0 mM 및 400 mM 에탄올 분석 플레이트와 그에 수반되는 적응 플레이트입니다 .
참고: 여기서 NGM 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 플레이트의 조성 차이, 특히 삼투압은 행동에 대한 에탄올의 용량 반응에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로는 동물에 의해 축적 된 에탄올의 양 변화에 기인합니다. NGM 한천은 160mOsm입니다.
- 건조 후 분석에 사용할 파종되지 않은 NGM 플레이트의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 빈 플레이트의 무게에 따라 플레이트에 있는 미디어의 부피를 결정합니다. 한천의 무게를 부피로 대략적으로 변환하려면 미디어의 무게가 동일한 부피의 물과 같다고 가정합니다.
참고: 가장 일관된 결과는 원래 10ml 용량의 건조 후 부피가 8.3–8.9ml 사이일 정도로 충분히 탈수된 NGM 배지에서 발견되었습니다. 2시간 건조 시간의 대안은 인큐베이터의 차이를 설명하기 위해 플레이트가 이 부피 범위에 도달할 때까지 건조하는 것입니다.
- 4개의 구리 고리(내경 1.6cm)를 각 판의 표면에 녹여 다양한 유전자형 또는 기생충 치료 그룹에 대한 우리 역할을 합니다. 집게로 각 링을 잡고 약 3초 동안 화염(분젠 버너의 강한 불꽃이 잘 작동함)에서 가열합니다. 즉시 집게로 링을 잡고 있는 상태에서 링을 접시에 올려 놓아 '건너뛰기'를 방지하십시오.
- 링의 여러 지점에서 집게로 부드럽게 눌러 링이 한천 표면에 평평하게 놓이도록 합니다. 반지를 놓을 때 추가로 3개의 반지를 넣을 수 있는 공간을 남겨 두도록 주의하십시오.
- 3개의 추가 구리 링을 플레이트 표면에 녹이고 4개 모두 카메라의 시야에 있도록 가능한 한 가깝게 배치하십시오.
참고: 한천으로 잘 밀봉하는 것은 분석 중에 고리에 있는 벌레를 유지하는 데 필수적입니다. 접시를 건너 뛰는 고리는 한천과 올바른 밀봉을 만들 가능성이 낮고 한천에 흉터를 남길 수 있으며, 이로 인해 벌레가 굴을 파고 벌레를 시각화하는 데 방해 가 될 수 있습니다.
- 각 분석 플레이트에 대해 함께 제공되는 "순응" 플레이트를 준비하며, 이 플레이트는 건조되고 파종되지 않아야 하며 에탄올을 받지 않습니다. 이 플레이트에 4개의 구리 링을 놓습니다.
- 각 고리 옆에 있는 판의 바닥에 고리에 사용할 웜 변형률로 레이블을 붙이고 고리 자체의 시야에 쓰지 않도록 주의하십시오. 분석 플레이트의 라벨을 함께 제공되는 순응 플레이트와 일치시킵니다.
- 최종 농도가 0mM 또는 400mM 에탄올(중량 대 부피)이 되도록 각 분석 플레이트에 추가할 100% 에탄올의 양을 계산합니다. 각 실험 (n = 1)에 대해 하나의 0 mM 및 하나의 400 mM 에탄올 플레이트가 있습니다. 적응 플레이트에는 에탄올이 공급되지 않습니다. 에탄올을 넣고 플레이트 표면 주위를 피펫으로 씌웁니다. 실험실 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 벤치 탑에서 2시간 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
- 1.5시간이 경과하면 분석의 적응 단계인 2.2단계를 시작합니다.
- locomotion assay 수행: Assay plates
- 각 실험 그룹의 웜 10개를 순응판의 구리 고리 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다. 이 시점에서 웜 픽으로 부드럽게 긁어 한천에 보이는 모든 음식을 제거하십시오. 동일한 균주가 여러 임상시험에서 동일한 순서로 플레이트에 배치되지 않도록 실험 그룹에 플레이트에 배치되는 순서를 변경합니다.
참고: 목표는 최소한의 음식으로 동물을 접시로 옮기는 것인데, 적응 플레이트의 음식이 분석 플레이트로 옮겨지면 벌레가 음식 주위에 모여지고 운동에 대한 약물의 영향이 모호해지기 때문입니다.
- 곡괭이로 한천의 표면을 깨뜨리지 않도록 주의하면 벌레가 굴을 파고 분석을 방해할 수 있으므로 주의하십시오. RT에서 30분 동안 벌레를 배양합니다.
- 각 플레이트의 시작 사이에 적절한 간격이 있는지 확인하십시오. 숙련 된 실험자는 1.5 분 안에 40 마리의 동물을 움직일 수 있으며, 10 마리의 동물< 4 개의 고리를 움직일 수 있지만 최대 2 분의 간격도 허용됩니다. 표준 분석은 0mM 및 400mM 에탄올 모두에 대해 10-12분 및 30-32분 노출로 녹화하는 동영상을 가지고 있습니다.
- 0mM 노출에 대한 순응 플레이트와 400mM 노출에 대한 순응 플레이트를 약 2분 30초 간격으로 시작하여 두 번째 무비가 시작되기 전에 첫 번째 무비 파일을 저장할 수
있도록 합니다.
- 30분의 적응 기간이 지난 후 적응 플레이트에서 분석 플레이트로 웜을 옮깁니다. 적응 플레이트에 추가된 것과 동일한 순서로 웜을 분석 플레이트(0mM 또는 400mM 에탄올)로 옮기고 각 플레이트의 완성 사이의 타이밍을 추적합니다. 기화로 인한 에탄올 손실을 최소화하기 위해 실험실 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
- 가장자리가 얇고 납작한 웜 픽으로 퍼내는 동작을 사용하여 평평한 픽 위에 웜을 수집합니다. 박테리아를 사용하지 않고 파종되지 않은 적응 플레이트에서 분석 플레이트로 웜을 이송하는 작업을 수행하는데, 이는 웜을 픽에 접착하는 데 도움이 되므로 웜을 옮기는 데 일반적으로 사용됩니다.
참고: 이 단계에서 동물이 이송되는 속도는 매우 중요한데, 그 이유는 플레이트의 첫 번째 웜이 플레이트에 추가된 마지막 웜보다 에탄올에 더 오래 노출되기 때문이며, 이전 시점은 일부 시간 종속 효과를 보일 수 있습니다. 이것이 실험 반복에서 플레이트에 먼저 균주를 배치하는 주된 이유입니다.
- Locomotion Assay 수행: 촬영
- 0.5x 현미경 대물렌즈, 0.8x 배율 및 2048x2048 7.4μm 픽셀 CCD가 있는 카메라와 같이 시야(약 42x42mm2제곱)에서 4개의 링을 모두 동시에 이미징할 수 있는 현미경/카메라 조합을 사용합니다.
- 시야 전체에 걸쳐 균일한 조명을 사용하여 intensity threshold 단계에서 물체를 인식하는 데 도움이 됩니다. 3"x3" 백라이트가 잘 작동합니다.
- 매체 면이 위로(뚜껑 아래로) 배치된 플레이트의 웜을 이미지화하면 기존 현미경 투과광원과 비교하여 백라이트를 사용할 때 손실되는 대비가 생성됩니다.
- 움직이는 웜의 타임랩스 동영상을 캡처하기 위해 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 1초마다 12비트 그레이스케일 이미지를 2분(120프레임) 동영상으로 캡처하도록 소프트웨어를 설정합니다. 충분한 이미지 해상도를 유지하면서 출력 파일의 크기를 줄이려면 2x2 비닝 모드를 사용하여 1024x1024 픽셀 이미지를 캡처합니다.
- 동영상을 녹화합니다. 첫 번째 플레이트(0mM 에탄올)의 120프레임 동영상 녹화를 해당 플레이트에 놓은 후 10분 후에 시작합니다. 동영상 파일을 저장합니다.
- 두 번째 플레이트(400mM 에탄올)를 기록합니다. 마지막 웜을 첫 번째 플레이트(0mM 에탄올)에 배치한 후 30분 후부터 두 플레이트에 대해 이 프로세스를 반복하여 각 노출에 대한 30-32분 시점을 캡처합니다.
참고: 분석할 다음 플레이트의 기록을 시작하기 전에 각 캡처 세션 후에 이미지를 저장할 수 있는 충분한 시간을 허용하십시오.
- 보관된 영화의 미래 보장을 위해 ImageJ와 같은 다른 공개 도메인 오픈 소스 이미징 소프트웨어 프로그램에서 이러한 영화를 열고 분석할 수 있도록 각 영화의 복사본을 8비트 256 그레이 스케일 TIFF 파일로 변환합니다.
참고: 여기에 설명된 이미지 분석 소프트웨어는 독점 파일 형식을 사용합니다.