1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

초록

출처: Lombardo et. al., 인간 유방암 조직 및 세포주에서 유방권 형성 분석. J. Vis. 특급. (2015).

이 비디오는 유방암 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 이러한 암 줄기세포를 배양하여 자가 재생을 평가하고 구 형성 효율성을 계산하기 위한 1차 유방구를 생성하여 다양한 시딩 밀도를 비교할 수 있습니다.

프로토콜

1. 인간 유방암 세포주에서 1차 유방권 생성

참고: 멸균 배양 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오.

1. 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100U/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12를 함유한 유방권 배지를 준비합니다. 20ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자(EGF; Sigma), 10ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; R&D Systems) 및 1x B27 보충제.
2. 부착성 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포(또는 원하는 유방암 세포주, 70-80% confluence)가 포함된 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x PBS에서 2회 세척한 다음 세포를 트립신화합니다.
3. 실온에서 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 1-5ml의 유방류 배지에서 상층액을 디캔트하고 세포를 재현탁합니다. 피펫을 위아래로 내리고 필요한 경우 40μm 셀 스트레이너 캡 필터를 사용하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 혈구계를 사용하여 단일 세포 현탁액이 형성되었는지 확인합니다(형성되지 않은 경우 25G 바늘을 사용하여 세포 현탁액을 최대 3회 주사기로 만듭니다).
4. 필요한 경우 anti-CD24-phycoerythrin (PE) 및 anti-CD44-fluorescein isothiocyanate (FITC) 단클론 항체를 사용하여 FACS를 통해 CD44+CD24- 세포 하위 집합을 분리합니다⁹. 또는 제조업체의 지침에 따라 anti-CD44 및 anti-CD24-biotin 결합 마이크로비드를 사용한 MACS(magnetic-activated cell sorting) 시스템을 사용하여 이러한 집단을 분리합니다. LS 컬럼을 사용하여 positive selection을 수행하고 LD 컬럼을 사용하여 negative selection을 수행하고 유세포 분석을 통해 모든 분리된 세포의 표현형을 확인합니다.
5. trypan blue.
   를 사용하여 ml당 생존 가능한 세포 수를 계산합니다. 메모: 세포 생존력은 생존 가능한 세포의 수를 혈구계의 그리드 내에 있는 총 세포 수로 나눈 값으로 계산됩니다. 트리판 블루를 흡수하는 세포는 생존할 수 없는 것으로 간주됩니다. 다음 절차는 생존 가능한 세포의 비율을 정확하게 결정하는 데 사용됩니다.
   1. PBS에서 0.4% 트리판 블루 용액을 준비합니다. 세포 1ml에 트리판 블루 스톡 용액 0.1ml를 추가합니다. 혈구계를 로드하고 저배율로 현미경으로 즉시 검사합니다. 전체 세포의 수와 파란색 염색 세포의 수를 세십시오. 실행 가능한 셀 = [1.00 – (파란색 셀 수 ÷ 총 셀 수)] × 100.
   2. 배양 ml당 생존 가능한 세포 수를 계산하려면 아래 공식을 사용하십시오. 희석 계수를 수정하는 것을 잊지 마십시오.
      생존 가능한 세포 수 × 10⁴ × 1.1 = 세포/ml 배양
6. 6-well ultra-low adherent plate의 각 well에 있는 2ml의 완전한 유방권 배지에 미리 결정된 양의 세포를 재현탁합니다. 파종 밀도는 일반적으로 우물당 500-4,000 cells/cm² cell입니다. 선택적으로 저부착성 24웰 플레이트를 사용하면서 0.5ml의 media.
   에서 동일한 밀도로 세포를 시딩합니다. 메모: 관심 있는 각 세포주에 대해 파종(seeding) 밀도와 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다.
7. 특히 처음 5일의 성장 단계에서 플레이트를 방해하지 않고 37°C 및 5% CO₂에서 5-10일 동안(세포주 및 유방구 크기에 따라 다름) 초저 부착 6-웰 플레이트를 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	론자	CC-3151
2mM L-글루타민	시그마 알드리치	G8540
100 U/ml 페니실린 & 스트렙토마이신	시그마 알드리치	P4083
20ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자(EGF)	시그마 알드리치	E9644
20ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)	R&D 시스템	제233-FB-025
1x B27 보충제	인비트로젠	제17504-044
인산염 완충 식염수(PBS)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	12399902
0.5% 트립신/0.2% EDTA	시그마 알드리치	59418씨
태아 송아지 세럼	퍼스트 링크 영국	02-00-850
트리판 블루	시그마 알드리치	93595
낮은 부착력 6웰 플레이트	코 닝	CLS3814

(영문) 호 )