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1. 인간 유방암 세포주에서 1차 유방권 생성
참고: 멸균 배양 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오.
- 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100U/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12를 함유한 유방권 배지를 준비합니다. 20ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자(EGF; Sigma), 10ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; R&D Systems) 및 1x B27 보충제.
- 부착성 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포(또는 원하는 유방암 세포주, 70-80% confluence)가 포함된 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x PBS에서 2회 세척한 다음 세포를 트립신화합니다.
- 실온에서 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 1-5ml의 유방류 배지에서 상층액을 디캔트하고 세포를 재현탁합니다. 피펫을 위아래로 내리고 필요한 경우 40μm 셀 스트레이너 캡 필터를 사용하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 혈구계를 사용하여 단일 세포 현탁액이 형성되었는지 확인합니다(형성되지 않은 경우 25G 바늘을 사용하여 세포 현탁액을 최대 3회 주사기로 만듭니다).
- 필요한 경우 anti-CD24-phycoerythrin (PE) 및 anti-CD44-fluorescein isothiocyanate (FITC) 단클론 항체를 사용하여 FACS를 통해 CD44+CD24- 세포 하위 집합을 분리합니다9. 또는 제조업체의 지침에 따라 anti-CD44 및 anti-CD24-biotin 결합 마이크로비드를 사용한 MACS(magnetic-activated cell sorting) 시스템을 사용하여 이러한 집단을 분리합니다. LS 컬럼을 사용하여 positive selection을 수행하고 LD 컬럼을 사용하여 negative selection을 수행하고 유세포 분석을 통해 모든 분리된 세포의 표현형을 확인합니다.
- trypan blue.
를 사용하여 ml당 생존 가능한 세포 수를 계산합니다.
메모: 세포 생존력은 생존 가능한 세포의 수를 혈구계의 그리드 내에 있는 총 세포 수로 나눈 값으로 계산됩니다. 트리판 블루를 흡수하는 세포는 생존할 수 없는 것으로 간주됩니다. 다음 절차는 생존 가능한 세포의 비율을 정확하게 결정하는 데 사용됩니다.
- PBS에서 0.4% 트리판 블루 용액을 준비합니다. 세포 1ml에 트리판 블루 스톡 용액 0.1ml를 추가합니다. 혈구계를 로드하고 저배율로 현미경으로 즉시 검사합니다. 전체 세포의 수와 파란색 염색 세포의 수를 세십시오. 실행 가능한 셀 = [1.00 – (파란색 셀 수 ÷ 총 셀 수)] × 100.
- 배양 ml당 생존 가능한 세포 수를 계산하려면 아래 공식을 사용하십시오. 희석 계수를 수정하는 것을 잊지 마십시오.
생존 가능한 세포 수 × 104 × 1.1 = 세포/ml 배양
- 6-well ultra-low adherent plate의 각 well에 있는 2ml의 완전한 유방권 배지에 미리 결정된 양의 세포를 재현탁합니다. 파종 밀도는 일반적으로 우물당 500-4,000 cells/cm2 cell입니다. 선택적으로 저부착성 24웰 플레이트를 사용하면서 0.5ml의 media.
에서 동일한 밀도로 세포를 시딩합니다.
메모: 관심 있는 각 세포주에 대해 파종(seeding) 밀도와 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다.
- 특히 처음 5일의 성장 단계에서 플레이트를 방해하지 않고 37°C 및 5% CO2에서 5-10일 동안(세포주 및 유방구 크기에 따라 다름) 초저 부착 6-웰 플레이트를 배양합니다.