PDX 종양 세포 표지를 위한 형질도입: In vitro에서 종양 세포에 형광 마커를 발현하는 렌티바이러스 도입

초록

출처: Hanna, C., et al. 종양 성장 및 전이 연구를 위한 추적 가능한 리포터를 사용한 유방암 환자 유래 이종이식편의 라벨링. J. Vis. 특급 (2016).

다음 비디오는 녹색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스와 루시페라제 리포터를 in vitro에 종양 세포에 도입하는 데 사용되는 PDX 종양 세포 라벨링(환자 유래 이종 이식편)으로의 형질도입 기술을 설명합니다.

프로토콜

1. PDX 유래 종양 세포의 형질도입

1. 원심분리기는 300g x 5분에서 종양 세포를 해리하고 2ml 유방권 배지에 재현탁합니다. 트리판 블루 배제를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다(5ml 세척 완충액에 소화된 세포를 재현탁하고 트리판 블루 배제를 사용하여 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 모두 계수합니다. 간단히 말해서, 50 μl의 세포와 50 μl의 트리판 블루를 혼합하고 혈구계를 사용하여 세포를 제외한 트리판-블루를 계수합니다.
2. 8μg/ml 폴리브레렌(배지 ml당 2μl의 스톡 폴리브레네)을 포함하는 10ml의 유방권 배지를 준비합니다.
3. 2 x 10⁵ 생존 가능한 종양 세포에 필요한 부피를 결정합니다. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 폴리브레렌 함유 배지 2ml에 재현탁합니다. 플레이트 2 x 10 6-well ultra-low adherence tissue culture plate.
   메모: 이는 하나의 렌티바이러스 벡터를 사용한 transduction에 필요한 최적의 세포 수입니다.
   주의!렌티바이러스 입자 및 렌티바이러스 입자와 함께 사용되는 모든 소모품은 재조합 DNA 생물학적 위험에 대한 제도적 절차에 따라 처리해야 합니다.
   메모: 원발성 유방 세포의 렌티바이러스 형질도입은 근상피 세포를 강력하게 선호하며, 이로 인해 루미널 세포의 라벨링이 불량하고 라벨링 중에 종양 세포의 하위 집단이 선택될 수 있습니다.
4. 형질도입 전 1시간 동안 37°C에서 200mU/ml 뉴라미니다아제로 바이러스를 배양하여 다른 1차 세포 하위 집단에 대한 바이러스 입자의 결합을 증가시키고 이러한 잠재적 편향을 보정합니다.
5. PDX 해리 세포가 Lin+ 마우스 세포에서 고갈되거나 EpCam+ 세포에서 농축된 경우 10 MOI(2 x 10⁶ TU 2 x 10 6 TU)에서 렌티바이러스 입자를 추가합니다. 비농축 PDX 해리 세포를 사용하는 경우 30 MOI(2 x 10⁵ 생존 세포의 경우 6 x 10⁶ TU)에서 렌티바이러스 입자를 추가합니다.
   메모: 증가된 MOI는 미처리 추출물에 많은 양의 파편과 죽은 세포가 존재하는 경우에도 효율적인 transduction을 가능하게 합니다. 생존력과 형질도입 효율에 대한 대조군 역할을 하기 위해 표지되지 않은 세포가 있는 웰을 보관하십시오.
6. 바이러스와 세포를 혼합하기 위해 소용돌이칩니다. 37 ° C, 5 % CO₂에서 최대 96 시간 동안 배양합니다. transfection 후 24시간 후에 500μl의 신선한 유방권 배지를 추가합니다. 세포는 플레이트에 부착되지 않으며 매체를 흡인하지 않습니다.

2. 면역이 저하된 마우스에서 라벨링된 세포의 형질도입 효율 및 재이식 평가

1. 10X 배율에서 형광 현미경을 사용하여 24시간마다 추적 가능한 마커(GFP)의 발현을 모니터링합니다.
   메모: GFP 발현은 감염 후 24시간 이내에 관찰할 수 있지만 대부분의 PDX에서 GFP 발현은 72시간 후에 명확하게 볼 수 있습니다(그림 1).
2. 전체 well.
   내에서 GFP+ 세포의 비율을 평가하여 transduction의 효율성을 추정합니다. 메모: 배양에는 다양한 정도의 종양 세포, 잔류 기질 세포 및 죽은 세포가 포함되어 있기 때문에 GFP+ 세포가 10% 정도로 낮은 웰을 숙주 마우스에 이식할 수 있습니다.
3. 6-well 플레이트에서 15ml 코니컬 튜브로 형질도입된 세포를 전달합니다. 웰에 유방권 배지 1ml를 추가하여 남아 있는 모든 세포를 수집합니다. 얼음 위에 놓습니다.
4. 형질도입된 세포에 HBSS/hepes 10ml를 추가하고 300 x g에서 5분, 4°C 동안 원심분리합니다.상등액을 조심스럽게 흡인하고 얼음 위에 50μl 기저 매트릭스 추출물(BME)에 재현탁합니다.
   메모: BME 부분 표본은 사용 1 - 2시간 전에 얼음에서 해동해야 합니다. BME는 실온에서 응고됩니다. 항상 얼음 위에 보관하십시오.
5. BME가 포함된 세포를 0.5ml 인슐린 주사기에 넣고 얼음에 보관한 다음 NSG 마우스에 재이식하기 위해 동물 시설로 가져옵니다.

결과

그림 1: 해리된 PDX 세포의 형질도입 효율 추적. A) pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro 렌티바이러스 입자로 형질도입 24시간 후 인간 상피세포(Lin+ 고갈)를 위해 농축된 PDX 해리 세포. B) 상피 세포 농축 없이 pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W로 형질주입 후 72시간 후에 실시한 별도의 실험에서 PDX가 해리된 세포. 두 패널 모두 살아있는 셀을 표시합니다. BF: 명시야 이미지, 막대는 50μm를 나타냅니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12 (1:1)	하이클론	SH30023.01
bFGF	BD 바이오사이언스	제354060
증권 시세	BD 바이오사이언스	354001
덤플링을	시그마	H4784
나27	Gibco/써모 피셔	17504-44
항진균제 항생제	하이클론	SV30010
HBSS 레드 Ca2+/Mg2+ 무함유	하이클론	SH30031.02
헤페스
컬트렉스	컬트렉스	Tel.: 3433-005-01	지하 매트릭스 추출물(BME)
30 °C 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽 CO. INC	시리즈 25 인큐베이터 셰이커

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