장기 조절 배지: 전이성 암 연구를 위해 수확된 장기 세포에서 배지 생성

초록

출처: Piaseczny, M. M., et al. 유방암 전이성 행동에 대한 장기 특이적 영향 연구를 위한 장기 조절 매체 및 응용 프로그램 생성. J. Vis. 특급(2016).

이 비디오는 쥐의 간에서 유래한 장기 조절 배지를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 모델 시스템은 장기 유래 용해성 인자와 그 요인이 암세포의 장기 영양성 및 전이성 행동에 미치는 영향을 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 폐 및 뇌 조절 매체의 생성

1. 무균 조직 배양 후드에서 폐 또는 뇌가 포함된 PBS 튜브를 세 번 뒤집어 장기에서 잔류 혈액을 제거하고 혈액이 포함된 PBS를 흡인합니다. 용액이 혈액의 흔적 없이 투명하게 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다.
2. 폐와 뇌를 별도의 60mm2 유리 페트리 접시에 넣습니다. 두 개의 멸균 메스 칼날을 사용하여 조직 조각이 약 ~ 1mm3 크기가 될 때까지 앞뒤로 반복적으로 잘라 폐나 뇌를 다집니다.
3. 계산된 중량 차이에서 조직 단편을 재현탁하는 데 필요한 배지의 양을 결정합니다.
   메모: 폐와 뇌 조직은 4:1 매체:조직 비율(vol/wt)로 재부유에 의해 체중이 정규화됩니다.
4. 1x 농축 미토겐 보충제 및 페니실린(50μg/ml)/스트렙토마이신(50μg/ml)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM):F12 배지의 적절한 부피(1.3단계에서 이전에 결정됨)로 조직 단편을 재현탁합니다.
5. 재현탁된 폐 또는 뇌 조직 조각을 6웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다.
6. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배지에서 조직 조각을 배양합니다. 배양 후 각 조직에 대해 컨디셔닝된 배지를 수집하고 50ml 원뿔형 튜브에 3개의 동등한 부피의 신선한 배지를 추가하여 추가로 희석합니다.
7. 4°C에서 각 장기에 대해 1,000 x g의 희석된 컨디셔닝 배지에서 15분 동안 원심분리기를 사용하여 큰 조직 파편을 제거합니다. 매체 상층액을 수집하고 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
8. 마우스에서 마우스로의 변동성을 설명하기 위해 여러 마우스에서 각 장기(즉, 폐와 폐, 뇌와 뇌)의 풀링된 배지를 추출합니다. 분취량으로 조절된 배지를 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1x 인산염 완충 식염수	써모피셔 사이언티픽	제10010-023	멸균 상태 유지
60mm2 유리 페트리 접시	시그마-알드리치	CLS7016560	멸균 상태 유지
DMEM: F12	생명 기술	제21331-020	사용하기 전에 37°C의 수조에서 따뜻하게 하고 멸균 상태로 유지하십시오.
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	생명 기술	15140-122	멸균 상태 유지
50ml 원뿔형 튜브	써모 사이언티픽(Nunc)	339652	멸균 상태 유지
0.22μm 실린지 필터	시그마-알드리치	Z359904	멸균 상태 유지
6웰 조직 배양 플레이트	써모 사이언티픽(Nunc)	140675	멸균 상태 유지
메스 블레이드	피셔 사이언티픽	S95937A	멸균 상태 유지

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