기계적 해리: 조직에서 생존 가능한 세포를 얻는 방법

초록

출처: Garaud et. al., 침윤 림프구 분석을 위해 신선한 인간 조직을 비효소적으로 해리하는 간단하고 빠른 프로토콜. J. Vis. 특급 (2014).

이 비디오는 생존 가능한 세포를 얻기 위해 신선한 인간 조직의 비효소적 해리를 설명합니다. 이 기술은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45 양성 세포(림프구/백혈구)의 정성 및 정량 분석에 사용됩니다.

프로토콜

1. 조직 균질산염의 준비

1. 절제된 조직(수술실에서 절제된 악성 및 정상 조직)은 훈련된 직원이 즉시 수거할 수 있도록 병리학 실험실에 있습니다. 종양, NANT(종양에서 가능한 한 가장 먼 거리) 및 정상 조직 조각은 인체 조직에 대한 표준 생물 안전성 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 외과적 절제 후 1-3시간 이내에 일상적으로 처리됩니다. 프로토콜의 순서도는 그림 1에 설명되어 있습니다.
2. 모든 조직 조각(정상, NANT 및 종양)의 무게를 측정하고 길이, 너비 및 높이(길이 x 너비 x 높이)를 측정합니다. 이것은 세포 하위 집단, 추출된 RNA 등의 후속 정규화를 위한 중요한 단계입니다.
   메모: 샘플 크기의 범위는 100-10,000 mm³이며 가능하면 지방이 없습니다.
3. H&E 염색을 위해 유리 슬라이드에 종양 조각을 각인하여 조직이 실제로 종양의 일부인지 확인합니다.
   1. 유리 현미경 슬라이드를 종양 조각에 대고 몇 초 동안 손가락으로 부드러운 압력을 가하면 됩니다.
   2. 이소프로판올로 슬라이드를 2분 동안 고정한 다음 물로 씻습니다. Mayer의 hematoxylin으로 조직을 30초 동안 대조 염색합니다.
   3. 6 개의 물로 슬라이드를 씻으십시오. 플록신 B에 15초 동안 2% 염색
   .
   4. 한 번의 물로 씻은 다음 이소프로판올을 네 번 씻고 한 번의 물로 마무리합니다.
   5. 이소프로판올에서 1분 동안 배양하고 물기를 뺍니다. 자일렌의 두 목욕에서 맑습니다.
   6. 크실렌 기반 장착 매체로 장착합니다. 종양 세포성 검사(그림 2).
      메모: 주로 종양 세포는 각인된 슬라이드에 달라붙습니다 - 기질 세포, 림프 세포 또는 지방 세포는 거의 남아 있지 않아 종양 세포 사이에 공간이 남습니다(그림 2).
4. 조직 조각을 실온에서 화학적으로 정의된 무혈청 조혈 세포 배지(이하 배지라고 함) 1ml가 들어 있는 작은 배양 접시에 넣고 멸균 메스를 사용하여 작은 조각(~1 - 2 mm²)으로 깍둑썰기합니다.
5. 모든 것(조직 조각 + 매체)을 기계적 해리기 C 튜브로 옮깁니다.
6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시와 메스를 배지 2ml로 헹구고 이를 C 튜브에 추가합니다(해리를 위한 배지 부피 = 3ml).
7. C 튜브에 대한 기계적 해리기 프로그램 A.01(가장 부드러운 프로그램)을 사용하여 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 균질화합니다. C 튜브를 장치에 놓고 프로그램을 연속으로 두 번(1주기 = 25초) 실행합니다.
   메모: 이 균질화 절차는 인간 유방 조직에 대해 확립되고 검증되었으며, 다른 종양 또는 조직 유형은 다른 프로그램을 사용해야 할 수 있으므로 먼저 테스트해야 합니다.
8. 장치에서 C 튜브를 제거하고 균질액을 50ml 튜브에 장착된 40μm 세포 스트레이너에 직접 디캔팅합니다. 1.6단계와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여 C 튜브에 남아 있는 모든 액체를 세포 여과기로 옮깁니다.
9. 1ml 마이크로피펫 팁을 사용하여 여과된 액체를 15ml 튜브에 옮깁니다. 세포 여과기와 50ml 튜브를 임시로 보관하십시오.
10. C 튜브를 추가로 3ml의 배지로 헹구고 1.6단계에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여 50ml 튜브에 여전히 장착된 셀 스트레이너로 옮깁니다. 깨끗한 파스퇴르 피펫 또는 1ml 팁으로 여과기 주위를 부드럽게 움직여 균질화되지 않은 조직에 갇힌 잔류 액체의 최대량을 50ml 튜브에 짜냅니다.
11. 세포 여과기를 원래 C 튜브에 거꾸로 놓고 배지 3ml로 헹구어 균질화되지 않은 조직이 C 튜브로 다시 떨어지도록 합니다.
12. A.01 프로그램의 두 사이클에 대해 1.7단계에서와 같이 재균질화합니다.
13. 이 두 번째 균질산물을 50ml 튜브에 장착된 세포 스트레이너를 통해 붓고, C 튜브를 3ml 배지로 다시 헹구고(단계 1.10과 같이) 파스퇴르 피펫을 사용하여 50ml 튜브에 장착된 셀 스트레이너로 다시 옮기고 세포 스트레이너에 갇힌 잔류 결합 조직에서 최대한의 액체를 짜냅니다.
14. 이 시점에서 15ml 튜브에는 ~2.5ml, 50ml 튜브에는 ~9ml의 부피가 있습니다.

2. 조직 상층액과 세포의 분리

1. 15 ml 및 50 ml 튜브의 균질화물을 실온에서 600 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
2. 15ml 튜브의 SN을 깨끗한 튜브에 넣고 4°C에서 임시로 보관합니다. 이 상등액 = 원발성 종양, NANT 또는 정상 조직 SN(최종 부피 2.5ml)은 향후 분석을 위해 -80°C에서 보관하기 전에 이후에 정화되고 분주화됩니다(아래 참조).
3. 50ml 튜브에서 상등액을 버립니다.
4. 두 세포 펠릿을 1ml 배지의 최종 부피로 부드럽게 재현탁합니다. 간단히 말해서, 먼저 두 튜브의 세포 펠릿을 부드럽게 부수십시오(단단한 표면에 튜브를 두드려서). 50ml의 느슨한 세포 펠릿을 500μl의 배지로 재현탁하고 이 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮겨 두 번째 펠릿을 재현탁합니다. 세포의 최대 회수를 위해 두 번째 500μl의 배지로 이 단계를 한 번 반복합니다.
5. 10μl의 세포 현탁액을 작은 튜브로 옮기고, 10μl의 트리판 블루(희석 1:1)와 혼합한 다음 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
   메모: 이 시점에서 세포 현탁액의 일부를 유세포 분석법으로 분석하여 세포 크기, 입도를 평가할 수 있으며, 광범위한 분석 또는 실험 전에 균질화에서 상대적 세포 분포를 보다 정확하게 평가하기 위해 원하는 경우 제한된 수의 하위 집단 마커를 평가할 수도 있습니다. 유세포분석에 의한 모든 분석은 subpopulation의 정규화를 위해 CD45 라벨링을 통합합니다.
6. 실온에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 종양, NANT 또는 정상 조직의 세포는 이제 추가 정제 또는 분석을 할 준비가 되었습니다. 이러한 추가 단계는 수술 당일에 수행하는 것이 가장 좋습니다.
   메모: 세포 분류가 아닌 유세포 분석의 경우, 세포 펠렛에 0.4ml의 적혈구 용해 완충액을 첨가하여 항체 라벨링 후 잔류 적혈구를 용해해야 하며, 즉시 1초 동안 볼텍싱하고 분석 전에 실온(빛으로부터 보호됨)에서 최소 10분 동안 배양해야 합니다.

3. 조직 상층액의 정화

1. 1.5ml 튜브와 조직 SN을 15,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
2. 펠릿을 만지거나 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오. 원하는 부분 표본의 수와 부피에 따라 깨끗한 튜브(또는 튜브)로 옮깁니다.
3. 나중에 사용할 수 있도록 상등액을 -80°C에 보관하십시오.

결과

그림 1: 프로토콜 순서도.새로운 인체 조직을 처리하는 절차와 인간 조직에 침투하는 림프구를 평가하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 분석 접근 방식이 나와 있습니다.

그림 2: 유방 종양 조직 각인의 H&E 염색 이미지.신선한 유방 종양 조직 조각에서 채취한 이 각인은 이식되지 않은 영역을 반영하는 열린 공간과 함께 종양 세포의 존재를 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
GentleMacs 디스 체인테이터	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-235	BD Medimachine은 다소 동일합니다
원심분리기 5810 R	에펜도르프		또는 다른 표준 탁상용 분리기
원심분리기 5417 R	에펜도르프		또는 다른 표준 마이크로 분리기
Esco Class II A2 생물안전 캐비닛	ESCO 글로벌		또는 기타 표준 BSL2 후드
도립 현미경	니콘 이클립스 TS100		또는 혈구계와 호환되는 다른 현미경
Bürker 챔버 마리엔필드		640210	또는 다른 표준 혈구계
Navios 유세포 분석기	벡크만 쿨터		또는 다른 유세포 분석기 (8-10 색상 권장)
젠틀맥스 C-튜브	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-344	BD Medimachine은 Filcon을 사용합니다
세포 배양 접시	사르슈테트	72,710	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
일회용 메스	스완-모튼	510	또는 표준 일회용 멸균 메스
BD 셀 스트레이너 40 μm	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	Tel.: 734-0002	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
BD 팔콘 튜브 50 ml	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	352070	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
BD 팔콘 튜브 15 ml	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	352097	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
BD FACS 튜브 5 ml	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	352008	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
멸균 파스퇴르 피펫 5ml	폭스바겐	612-1685	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
마이크로퓨지 튜브 1.5ml	에펜도르프	7805-00	또는 다른 비 발열성 플라스틱 그릇
X-비본 20	론자	BE04-448Q	무혈청 배지 권장
인산염 완충 식염수	론자	BE17-516F	표준 생리학적 PBS
트리판 블루	폭스바겐	17942E	또는 기타 중요한 얼룩

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