Soft Agar Colony Formation Assay: 암세포 증식에 대한 새로운 화합물의 효과를 테스트하는 방법

초록

출처: Horibata A. et. al., 유방암 세포에서 종양 원성 억제제를 식별하기 위한 연질 한천 식민지 형성 분석의 활용. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 유방암 종양 원성에 대한 PADI 효소 억제제와 BB-Cl-아미딘의 효과를 시험관내에서 테스트하기 위한 부드러운 한천 집락 형성 분석을 설명합니다. 이 분석은 또한 유전적 교란의 맥락에서 세포 형질전환 가능성의 정량적 평가를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 3 % 2- 하이드 록시 에틸 아가 로스의 제조

1. 깨끗하고 마른 100ml 유리병에 2-하이드록시에틸 아가로스(아가로스 VII) 0.9g과 증류수 30ml를 넣습니다.
2. 혼합물을 전자레인지에 15초 동안 돌리고 부드럽게 휘젓습니다. 아가로스 가루가 완전히 녹을 때까지 이 단계를 최소 3회 더 반복합니다.
3. 용액이 들어있는 병을 15분 동안 오토클레이브합니다.
4. 더 사용하기 전에 아가로스 용액을 RT로 식히십시오. RT에 솔루션을 저장합니다.

2. 바닥층의 준비 : 0.6 % 아가로 스 젤

1. 취급 시 피펫에서 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 37°C 인큐베이터에서 여러 개의 5ml 및 10ml 피펫을 예열합니다.
2. 병 뚜껑을 부분적으로 풀고 미리 만들어진 3% 2-하이드록시에틸 아가로스 용액을 전자레인지에 15초 동안 돌립니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 휘젓고 전자레인지에 15초 더 돌립니다.
   주의: 아가로스 용액을 휘젓을 때 용액이 공기에 노출되면 위로 올라와 넘칠 수 있으므로 주의하십시오.
3. 병에 고체 젤이 남아 있으면 전자레인지에 몇 초 더 돌립니다.
4. 다음 단계에서 아가로스 용액이 들어 있는 병을 45°C 수조에 보관하여 아가로스 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하십시오.
5. 37 ° C 수조에서 따뜻한 MCF10DCIS 매체를 사용하십시오 .
   메모: MCF10DCIS 배지는 DMEM/F12, 5% 말 혈청, 5% 페니실린 스트렙토마이신으로 구성됩니다.
6. 예열된 피펫을 사용하여 3% 아가로스 용액 3ml를 멸균 50ml 원추형 튜브에 넣습니다.
7. 즉시 12ml의 따뜻한 MCF10DCIS 매체를 추가하고 원뿔형 튜브를 부드럽게 뒤집어 아가로스를 매체와 혼합합니다. 나중에 식민지 계산을 방해하므로 거품을 형성하지 마십시오.
8. 이 혼합물 2ml를 기포를 형성하지 않고 6웰 배양판의 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.
9. 혼합물이 응고될 수 있도록 4°C의 평평한 표면에 6웰 배양 플레이트를 1시간 동안 수평으로 배양합니다.
10. 혼합물이 응고된 후 플레이트를 37°C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 맨 아래 레이어를 사용할 준비가 되었습니다.

3. 세포 함유 층의 준비 : 0.3 % 아가 로스 겔

1. MCF10DCIS 세포를 트립신화하고 4 x 10⁴ /ml의 세포 농도로 희석합니다.
2. 예열된 피펫을 사용하여 3% 아가로스 2ml를 멸균된 50ml 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
3. 즉시 8ml의 MCF10DCIS 매체를 원뿔형 튜브에 넣고 부드럽게 뒤집어 아가로스를 매체와 혼합합니다. 거품이 생기지 않도록 하십시오.
4. MCF10DCIS 세포 2ml(4 x 10,⁴/ml)를 취하고 BB-CLA(0μM(DMSO) 또는 1μM)로 처리합니다.
5. 1:1 희석에서 세포를 0.6% 아가로스와 혼합합니다.
6. 세포-아가로스 혼합물 1ml를 6웰 배양판의 바닥층(2 x 10,⁴ cells/ml)에 부드럽게 첨가합니다.
7. 6웰 배양 플레이트를 4°C의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓아 최상층이 응고되도록 합니다.
8. 혼합물이 응고된 후 공급 층을 추가하기 전에 일주일 동안 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.

4. 피더 층의 준비 : 0.3 % 아가 로스 겔

1. 미리 만들어진 3% 2-하이드록시에틸 아가로스 용액을 전자레인지에 15초 동안 돌리고 용액을 부드럽게 휘젓고 전자레인지에 15초 더 돌립니다.
2. 아가로스 용액 병을 45°C 수조에서 평형을 이룹니다.
3. 37°C 수조에서 MCF10DCIS 매체를 데웁니다.
4. 3% 아가로스 용액 1ml와 따뜻한 MCF10DCIS 미디어 9ml를 50ml 원뿔형 튜브에 혼합하고 부드럽게 뒤집어 아가로스를 미디어와 혼합합니다. 기포가 형성되지 않도록 하십시오.
5. 혼합물을 BB-CLA (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)로 처리합니다.
6. 이 혼합물 1ml를 (기포를 형성하지 않은) 바닥과 부드러운 층을 포함하는 6-well 배양 플레이트의 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.
7. 혼합물이 응고될 수 있도록 6웰 배양 플레이트를 4°C의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓습니다.
8. 피더 층이 응고된 후 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
9. 콜로니 형성이 관찰될 때까지 세포에 새로운 배지를 보충하기 위해 기존 공급층에 0.3% 아가로스/배지/처리 용액 1ml를 오버레이하여 매주 이 공급 절차를 반복합니다.
   메모: 연질 층과 피더 층의 한천은 매우 부드럽기 때문에 피더 층에서 추가 된 영양분은 세포 함유 층으로 쉽게 확산되어 세포에 도달합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자이스 액시오팟	Carl Zeiss 현미경 검사	1021859251
도립 현미경	올림푸스	CKX41
DMEM/F-12	론자 바이오휘태커	12-719층
HyClone 기증자 말 세럼	피셔 사이언티픽	SH30074.03
페니실린 스트렙토마이신	생명 기술	15140-122
2-하이드록시에틸라가로오스: VII형, 낮은 겔화 온도	시그마-알드리치	39346-81-1

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