꼬리 정맥 주사: 마우스 모델에서 전이성 연구를 위한 암세포 투여 방법

초록

출처: Warren et al., Combined use of Tail Vein Metastasis Assay와 Real-Time In Vivo Imaging을 사용하여 유방암 전이성 집락화 및 폐 부담 정량화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 꼬리 정맥 주입을 사용하여 표지된 암세포를 마우스 모델에 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 또한 실시간 생체 내 살아있는 동물 이미징을 사용하여 유방암, 전이 형성 및 성장을 모니터링합니다.

프로토콜

1. 표지된 암세포의 꼬리 정맥 주입

참고: Step 1.2.4는 syngeneic BALB/c 마우스에서 성장하는 4T1 세포에 최적화되었습니다. 다른 암 세포주와 마우스 균주를 사용하는 경우 주입되는 세포의 수와 분석의 길이를 먼저 최적화해야 합니다.

1. 완전한 성장 배지에서 2개의 15cm 접시에서 2단계에서 생성된 4T1 세포주를 확장하여 주입 당일에 초과 세포를 사용할 수 있도록 합니다.
2. 다음과 같이 꼬리 정맥 주입을 위해 세포를 준비합니다.
   1. 배지를 흡입하고 1x PBS로 세포판을 헹굽니다.
   2. 15cm 플레이트당 5mL의 트립신으로 세포를 2-5분 동안 트립신화합니다(세포는 웰 바닥을 자유롭게 헹궈야 함). 모든 세포를 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직 배양 접시에 남아 있는 세포를 트립신을 담금질하기에 충분한 완전한 성장 배지로 세척하고 세척액을 동일한 원뿔형 튜브에 추가합니다.
   3. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산하여 총 셀 수를 확인합니다.
   4. 122 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 원하는 농도로 1x PBS에 세포를 재현탁합니다. 여기서, 2.5 x 10⁴ 세포는 100 μL의 PBS에 각 마우스에 주입되므로 2.5 x 10⁵ cells/mL에서 세포를 재현탁합니다. 주입될 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 두십시오.
      참고: 세포의 트립신화와 꼬리 정맥 주입 사이의 시간을 약 1시간으로 제한하는 것이 중요합니다.
3. 다음과 같이 1.2.5단계의 4T1 세포를 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입합니다.
   1. 동물 시설의 후드 안에서 작업하면서 튜브를 뒤집거나 1mL 주사기를 사용하여 세포가 균일하게 재현 유탁되도록 하여 세포를 부드럽지만 철저하게 혼합합니다. 주사기를 로드하기 전에 항상 세포가 재현탁되었는지 확인하십시오.
   2. 1mL Luer-lock 주사기에 세포 현탁액을 로드하고 과도한 기포를 배출합니다. 베벨이 위로 향하게 하여 주사기에 1/2인치, 30게이지 바늘을 놓고 기포를 배출합니다.
   3. 마우스를 설치류 구속기에 부드럽게 놓습니다.
   4. 측면 꼬리 정맥은 보이고 확장되어야 합니다. 그렇지 않은 경우 꼬리 바닥을 부드럽게 꼬집고 꼬리를 따뜻한 수돗물에 담궈 정맥을 확장시킵니다.
      메모: 정맥의 확장은 마우스 케이지를 가열 램프 아래 및/또는 가열 패드 위에 배치하여 달성할 수도 있습니다.
   5. 알코올 물티슈를 사용하여 꼬리를 청소하십시오. 바늘을 꼬리 정맥에 삽입하고 경사면이 위로 향하게 한 다음 100μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
      메모: 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 앞뒤로 약간 쉽게 미끄러져야 하며 플런저를 밀 때 저항이 없어야 합니다. 성공적인 주사는 또한 주사 후 몇 초 동안 정맥의 파란색이 흰색으로 변하는 "플러시"를 초래해야 합니다.
4. 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여 주입 부위에 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.
5. 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전히 회복되도록 합니다. 생쥐는 매주 3번 통증이나 괴로움의 징후가 있는지 확인해야 합니다.
6. in vivo 살아있는 동물 이미징 장치를 사용하여 3-6주(세포주 및 마우스 균주에 따라 다름) 동안 마우스의 전이 형성 및 성장을 모니터링합니다(단계 1.5 및 1.6 참조).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2.5% 트립신	지브코	제15090-046	조직 배양을 위한 트립신
알코올 물티슈			꼬리 정맥 injecitons 전에 주입 부위를 sterolizing하기 위해
BALB/C 마우스(암컷, 6주)	타코닉	발브-F	꼬리 정맥 전이성 집락화 및 부담 분석용
둘베코&39; S 인산염 완충 식염수	히미디어	TS1006
에디타	폭스바겐	97061-406	조직 배양을 위해 트립신을 희석하는 데 사용됩니다.
FBS 100% 미국 원산지	폭스바겐	97068-085	완전한 성장 배지의 구성 요소
L-글루타민	지브코	제25030-081	완전한 성장 배지의 구성 요소
마우스 유방암 세포, 4T1	카르마노스 암 연구소	Aslakson, CJ 외, 1992	마우스 전이성 유방 캔스 세포주
페니실린 스트렙토마이신	지브코	15140-122	완전한 성장 배지의 구성 요소

호 호 년