CTC Immunofluorescence Assay : 순환 종양 세포를 특성화하는 기술

초록

출처: Garcia, J., et al. 면역형광에 의한 비소세포폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 계수.J. Vis. 특급(2019년)

이 동영상은 비소세포폐암 환자 샘플에서 순환 종양 세포의 바이오마커를 특성화하는 기술인 순환 종양 세포(CTC) 면역형광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 종양의 동적 변화와 면역 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있으며, 이는 화학 요법, 방사선 요법 및 가능한 면역 요법 치료에 대한 반응을 반영할 수 있습니다.

프로토콜

1. 면역형광 염색

1. 혈구계(hemocyometer)형 그리드가 있는 챔버 슬라이드에서 mL당 세포 수를 열거합니다. 농축된 시료를 0.2% 결합 방지 용액(Table of Materials)으로 시토스핀당 100,000 cells/100 μL에 도달하는 농도로 희석합니다.
2. 면(Table of Materials)을 사용하여 50μL의 0.2% 결합 방지 용액을 사용하여 시료 챔버의 윤곽을 적십니다. 폴리리신 유리 슬라이드를 시료 챔버에 놓고 닫습니다.
3. 팁을 0.2% 항결합 용액으로 위아래로 3회 피펫팅하여 코팅합니다. 농축된 샘플을 재현탁하고 세포 용액을 샘플 챔버로 옮깁니다. 전용 원심분리기(Table of Materials)가 있는 원심분리기, 400rpm에서 4분(저가속) 동안 원심분리기.
4. 증착 영역 주위에 실리콘 절연체를 놓습니다. 미생물 안전 캐비닛 아래에서 유리 슬라이드를 2분 동안 건조시킵니다.
5. 16% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 멸균 PBS 3mL로 희석하여 고정 용액을 준비합니다. 샘플당 100μL의 고정 용액(4% PFA)을 추가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 고정 용액을 제거하고 200μL의 PBS로 3회 세척을 수행하고 각각 2분 동안 상온에서 배양합니다.
   주의 : 흡입을 방지하기 위해 화학 안전 캐비닛 아래에 PFA를 사용하십시오.
6. 소태아혈청(FBS)을 5%, Fc 수용체(FcR) 차단 시약을 5%, 소 혈청 알부민(BSA)을 1%로 무균 PBS에 희석하여 포화 용액을 제조합니다(Table of Materials). 샘플당 100μL의 포화 용액을 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 포화 용액을 제거합니다.
7. 시료당 100μL의 항체 용액을 추가합니다(CD45 항체 1/20; PanCK 항체 1/500; PD-L1 항체 1/200; Qsp 포화 용액 100 μL) (재료 표). 폴리리신 유리 슬라이드를 100mm x 15mm 페트리 접시에 놓습니다. 살균수 2mL를 흡수지에 적셔 뚜껑으로 페트리 접시를 닫습니다. 4°C에서 하룻밤 동안 방치하고 빛으로부터 보호하십시오.
8. 항체 혼합물을 제거하고 200μL의 PBS로 3회 세척을 수행하여 각 세척을 2분 동안 배양합니다. 샘플을 5분 동안 건조시키고 빛으로부터 보호하십시오. 증착 영역에 10μL의 마운팅 용액(Table of Materials)을 놓고 기포를 만들지 않고 현미경 커버슬립으로 덮습니다. 커버슬립을 매니큐어로 밀봉하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플루로닉 F-68 10%	지브코	제24040-032	바인딩 방지 솔루션. 보관 조건: 실온
EZ 사이토퍼널	써모피셔	A78710003	면이 함유된 시료 챔버. 보관 조건: 실온
Shandon Cytopsin4 원심분리기	써모피셔	A78300003	전용 원심분리기. 보관 조건: 실온
파라포름알데히드 16%	써모피셔	11490570	정착 해결책. 보관 조건: +4°C
인산염 완충 식염수 울트라 퓨어 등급 1X – 1L	제1 베이스 연구소	BUF-2040-1X1L	보관 조건: 실온
FcR 차단제	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-059-901	보관 조건: +4°C
PD-L1 단클론 항체 (클론 29E2A3) - Phycoerythrin	바이오레전드	BLE329706	보관 조건: +4°C
PanCK 단클론 항체 (클론 AE1/AE3) Alexa Fluor 488	써모피셔	Tel.: 53-9003-80	보관 조건: +4°C
CD45 단클론 항체 (클론 HI30) Alexa Fluor 647	바이오레전드	BLE304020	보관 조건: +4°C
플루오로마운트	시그마	F4680	마운팅 솔루션. 보관 조건: 실온
페트리 접시	더처	632180	보관 조건: 실온
인산염 완충 식염수(PBS)	오자임	BE17-512F	보관 조건: +4°C
폴리리신 슬라이드	써모피셔	J2800AMNZ	보관 조건: 실온
실리콘 아이솔레이터	그레이스 바이오 랩스	664270	보관 조건: 실온
멸균 탈이온수 – 100mL	제1 베이스 연구소	커스 4100-100ml	보관 조건: 실온
송아지 태아 혈청(FCS)	지브코	10270-106	보관 조건: +4°C