Whole Lung Agarose Inflation: 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하는 방법

초록

출처: Van den Bijgaart R.J.E. et al., 폐 전이 및 미세환경의 생체 외 실시간 이미징, J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 인플레이션을 위해 아가로스를 사용하여 암세포와 기질 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하는 방법을 설명합니다. 샘플 프로토콜에서는 살아있는 세포 상호작용을 관찰하기 전에 아가로스 팽창 절차가 설명됩니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생체 외 라이브 이미징을 위한 폐 준비

참고: 폐 내 면역 세포의 불필요한 도전을 피하기 위해 가능한 한 멸균되고 조심스럽게 작업하십시오.

1. IACUC에서 승인한 동물 프로토콜에서 허용한 마취제의 치사량 과다 투여(예: 2.5% Avertin 1ml)를 마우스에 복강내(i.p.)에 주입합니다. 마우스가 호흡을 멈추고 유해한 자극(뒷발 꼬집음)에 완전히 반응하지 않을 때까지 기다립니다.
   참고: 자궁경부 탈구와 이산화탄소 안락사는 폐 세포 생존력에 해로운 영향을 미칠 수 있으므로 피해야 합니다.
2. 해부판에 마우스를 고정시키고 70% 에탄올로 마우스를 살균합니다.
3. 수술용 가위를 사용하여 먼저 피부를 통해 횡방향 상복부 절개를 한 다음 복막을 통해 유사한 절개를 만듭니다. 박리판을 수직으로 잡고 하강하는 대동맥을 절단하여 혈액이 흉강이 아닌 복부에 고이
도록 합니다.
4. 다이어프램의 작은 구멍을 잘라 진공을 해제합니다. 10번째와 12번째 갈비뼈를 따라 잘라 횡격막을 절제하고 폐에 육안으로 접근할 수 있도록 합니다.
5. 수술용 가위를 사용하여 흉곽 위의 기관까지 피부를 자르되 흉곽은 그대로 둡니다. 흉곽에서 피부를 분리하십시오. 기관 자체가 손상되지 않도록 주의하면서 주변의 결합 조직을 제거하여 기관을 노출시킵니다(그림 1A).
6. 연골 고리와 평행하게 노출된 기관에서 직경 약 1mm의 작은 구멍을 후두에 최대한 가깝게 잘라냅니다(그림 1B). 기관을 완전히 절단하지 않도록 주의하십시오.
7. 20G 바늘을 잡고 반대 힘 없이 바늘을 기관에 4-5mm 부드럽게 삽입합니다(그림 1D). 바늘의 끝은 기관을 통해 볼 수 있어야 합니다(그림 1C). 집게를 사용하여 기관의 바늘을 고정합니다. 또는 바늘을 제자리에 고정하기 위해 기관 주위에 봉합사를 묶을 수 있습니다.
   참고: 너무 깊숙이 삽입하면 카리나가 외상을 입거나 폐의 한쪽만 팽창할 수 있습니다.
8. 주사기에 37°C 2% 저용융 온도 아가로스 400μl(항온 수조에서 직접 채취)를 채웁니다. 해부 보드가 세워져 있는지 확인하고 바늘을 통해 따뜻한 아가로스를 폐에 천천히 주입하고 ~400μl를 사용하여 폐를 팽창시킵니다.
   알림: 흉곽 내부에서 폐가 팽창하는 것을 관찰하십시오. 폐가 파열될 수 있으므로 과도하게 팽창시키지 마십시오.
9. 폐가 팽창하여 흉곽의 ~2/3를 채우고 주사기를 분리하고 바늘을 기관 내부에 두어 아가로스가 누출되는 것을 방지합니다.
10. 팽창된 폐에 약 50ml의 20°C PBS를 부어 폐 내부의 아가로스가 굳고 응고되도록 합니다. 천천히 바늘을 제거하고 집게로 기관을 닫아 응고되지 않은 아가로스가 누출되는 것을 방지합니다.
11. 흉골 절개술을 시행하여 폐를 노출시킨 후 폐를 절제합니다. 폐를 절제하려면 기관을 완전히 절단하면서 기관을 잡습니다. 기관을 부드럽게 위로 당기고 결합 조직과 식도를 잘라내면서 폐가 마우스에서 분리될 때까지 흉강에서 폐를 빼냅니다(그림 1E).
12. 폐를 따뜻한 RPMI-1640에 담궈 과도한 혈액을 씻어내고 가위와 집게를 사용하여 엽의 주요 줄기 기관지를 문턱에서 잘라 엽을 부드럽게 분리합니다(그림 1F).
13. 이미징 표면을 최대화하기 위해 평평한 표면이 아래로 향하도록 로브를 24웰 이미징 플레이트의 웰에 배치합니다(그림 1G). 엽 위에 100μl의 37°C RPMI-1640을 추가합니다. 엽 위에 여러 개의 15mm 원형 현미경 덮개 슬라이드를 놓아 뜨는 것을 방지합니다.
14. RPMI-1640 매체가 증발하는 것을 방지하기 위해 따뜻한 PBS를 주변 웰에 붓습니다. 24웰 플레이트를 평형 기후 챔버에 삽입하고 공기와 5% CO₂로 폐엽을 37°C로 유지합니다. 컨포칼 현미경의 스테이지에 기후 챔버를 삽입합니다.
    참고: 다른 가스 혼합물(예: 저산소증/저산소 조건에서 세포 거동을 검사하기 위한 N₂의 5% O ₂, 5% CO₂)도 고려할 수 있습니다.

결과

그림 1. 라이브 이미징을 위한 폐 준비를 위한 프로토콜.(A) 마우스 준비 후 기관 노출. (B) 연골 고리와 평행하게 노출된 기관에서 만들어진 작은 싹둑. (C) 기관에 4-5mm 삽입된 20G 바늘. (D) 400 μl 2% 저용융 온도를 폐에 주입합니다. (E) 마우스에서 분리된 팽창된 폐. (F) 인플레이션 후 분리된 엽. (G) 24웰 이미징 플레이트의 웰에 배치된 엽.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마 취	해당 없음	해당 없음	IACUC에서 승인한 마취, 마취 및/또는 안락사에 사용
PBS, USP 멸균	암레스코 INC	K813-500ML	I.V. 주입을 위한 초순수 등급
1X PBS	UCSF 세포 배양 시설	해당 없음
스티로폼 플랫폼	해당 없음	해당 없음	해부 보드로 사용됩니다.
날카로운 고급 가위	정밀 과학 도구	14060-11
20G× 바늘 1개, 짧은 베벨	BD (영어)	305178
집게	로보즈 서지컬 스토어	RS-5135
바늘이 없는 1mL 주사기	BD (영어)	309659
저용융 온도 아가로스	론자	50111	용액 10ml를 만들려면 아가로스 0.2g의 무게를 달고 10ml 1 x PBS에 넣고 가열하여 녹입니다. 아가로스는 실온에서 응고되므로 팽창에 사용할 때까지 37°C의 수조에서 유지하십시오.
페놀 레드가 없는 RPMI-1640 배지	생명 기술	11835-030
24웰 이미징 플레이트	E&K 사이언티픽	EK-42892
유리 커버 슬라이드, 15mm	피셔 사이언티픽	Tel.22-031-144
디지털 CO2 및 온도 컨트롤러	오콜랩	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
기후 챔버	오콜랩	해당 없음	http://www.oko-lab.com
Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경	자이스	해당 없음
공기	증권 시세	해당 없음
산소	증권 시세	해당 없음
이산화탄소	증권 시세	해당 없음

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