폐암종 세포의 3차원 배양: 세포-매트릭스 상호작용을 연구하는 방법

초록

출처: Chen, S. et. al. 폐 편평 암종 진행을 모델링하는 다차원 공동 배양 시스템. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 세포-매트릭스 상호 작용을 연구하기 위한 폐암 세포의 3D 배양 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서는 TUM622 폐암 세포의 3D 배양을 수행하여 in vitro에서 오가노이드를 형성할 수 있는 가능성을 탐구할 것입니다.

프로토콜

1. 2D 배양에서 TUM622 세포의 패시징 및 배양

1. 37°C에서 TUM622 세포를 위한 온열 3D 배양 배지 및 세포 해리 시약(재료 표 참조).
2. 2D 플라스크에서 80% 포화도의 TUM622 세포를 계대. 일반적으로 이것은 패싱한 지 1주일 후에 발생합니다.
3. T75 플라스크에서 오래된 배지를 버리고 6mL의 HEPES 버퍼로 한 번 세척합니다. 세포에 직접 피펫팅하지 마십시오.
4. HEPES 버퍼를 흡인합니다. 빠른 헹굼을 위해 4mL의 트립신/EDTA(0.25mg/mL, 재료 표 참조)를 추가하고 트립신/EDTA를 폐기합니다.
5. 트립신/EDTA 2mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 플라스크를 두드려 기포를 생성하지 않고 세포를 느슨하게 하고 플라스크를 추가로 5분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   메모: 트립신에 장기간 노출되면 세포가 돌이킬 수 없는 손상을 입게 되고 표현형이 변하게 되므로 세포가 트립신에 노출되는 시간을 제한하는 것이 좋습니다.
6. 세포가 광학 현미경(4x 또는 10x)으로 분리 및 해리되었는지 확인합니다. 4mL의 중화 완충액(TNS 완충액)(재료 표의 계대배양 시약 정보 참조)을 추가한 다음 10mL의 3D 배양 배지(재료 표 참조)를 추가합니다.
7. 10mL 피펫을 사용하여 세포를 추가로 해리하기 위해 부드럽게 위아래로 피펫을 사용합니다. 40μm 세포 여과기를 통해 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
8. 혈구계(hemocyometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
9. 0.8 x 10⁶ cells/T75 플라스크를 20mL의 3D 배양 배지에 시딩합니다(재료 표 참조).
10. 격일로 사용한 배지의 절반을 새로운 배지로 교체하여 세포에 공급합니다.

2. 3D 배양을 위한 세포외 매트릭스의 TUM622 세포 도금

1. 실험 전날, 기저막 매트릭스의 바이알을 4°C 냉장고에서 밤새 해동합니다. 플라스틱 피펫(2mL)과 팁을 -20°C에서 하룻밤 동안 냉각시킵니다.
   메모: 모든 기저막 매트릭스가 TUM622 세포의 3D 성장을 지원할 수 있는 동일한 용량을 가지고 있는 것은 아닙니다. 따라서 강력한 아시니 형성을 지원하는 매트릭스를 식별하기 위해 여러 로트의 기저막 매트릭스를 획득하고 테스트해야 합니다. 일반적으로 이를 위해서는 매트릭스에서 더 높은 단백질 농도(16-18 mg/mL)가 필요합니다.
2. 실험 당일, 37 ° C 수조에서 따뜻한 3D 배양 배지, HEPES 완충액, 트립신 / EDTA 및 트립신 중화 완충액 (TNS). 배양액을 설정하기 직전에 냉장고에서 해동된 기저막 매트릭스를 꺼내 바이알을 얼음 위에 올려 놓습니다.
3. 얼음 위에 놓인 금속 플랫폼 쿨러의 조직 배양 플레이트를 냉각시킵니다. 얼음 위의 금속 냉각 랙에 원심분리기 튜브를 놓습니다.
4. 1.7단계에서 얻은 TUM622 셀을 사용하여 도금에 필요한 원하는 셀 수를 계산합니다. 일반적으로 24웰 플레이트의 웰당 15,000-30,0000개의 세포가 필요합니다. 낮은 밀도는 이미징 및 정량화에 더 적합하며, RNA 추출 또는 웨스턴 블로팅을 위해 세포를 수집할 때는 더 높은 밀도가 선호됩니다.
5. 세포 현탁액을 냉각된 원심분리기 튜브(각 튜브에는 3중 도금을 위한 세포가 포함되어 있음)로 옮기고 4°C의 행잉 버킷 원심분리기에서 5분 동안 300 x g로 스핀다운합니다.
6. 여과되지 않은 팁(20μL)에 부착된 흡인 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡입하고 튜브에 약 100μL의 배지를 남겨둡니다(튜브의 표시를 가이드로 사용).
7. 튜브 측면을 부드럽게 두드려 펠릿을 제거하고 분리한 후 냉각 랙에 다시 넣습니다.
8. 사전 냉각된 2mL 피펫을 사용하여 바이알이 얼음에 닿은 상태를 유지하면서 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 매트릭스를 부드럽게 혼합합니다. 이 과정에서 매트릭스에 기포가 유입되지 않도록 균일하고 적당한 속도로 피펫팅합니다.
9. 적절한 부피의 매트릭스를 각 원심분리 튜브로 옮깁니다. 24웰 플레이트에서 3중을 도금하려면 각 튜브에 1.1mL의 기저막 매트릭스를 추가합니다.
10. 사전 냉각된 팁을 사용하여 각 튜브의 매트릭스를 약 10회 위아래로 피펫팅하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다.
11. 310μL의 셀/매트릭스 현탁액을 사전 냉각된 24웰 플레이트의 각 웰로 전달합니다. 피펫은 플레이트 표면에 대해 90° 각도로 배치되고 현탁액은 웰 중앙에 추가됩니다. 서스펜션은 플레이트를 기울일 필요 없이 퍼져 전체 우물을 덮어야 합니다.
12. 다운스트림 면역형광 분석을 용이하게 하려면 세포/매트릭스 현탁액을 2-well 챔버 슬라이드에 병렬로 플레이트링합니다. 100μL의 셀/매트릭스 현탁액을 2웰 챔버 슬라이드의 웰 중앙으로 이동합니다(재료 표 참조). 이를 통해 매트릭스는 훨씬 더 작은 부피를 가진 돔과 같은 구조를 형성할 수 있습니다.
13. 플레이트와 챔버 슬라이드를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣고 매트릭스가 응고될 때까지 30분 동안 배양합니다. 광학 현미경으로 플레이트/슬라이드를 검사하여 단일 세포가 매트릭스 내에 고르게 분포되어 있는지(4x 또는 10x) 확인합니다.
14. 각 웰에 예열된 3D 배양 완료 배지 1mL를 추가하고 챔버 슬라이드의 각 웰에 3D 배양 배지 1.5mL를 추가한 다음 인큐베이터로 다시 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
기관지 상피 성장 배지	론자	CC-3170 BEGM
셀 스트레이너 40um	써모피셔	352340	TUM622 셀 통과용
쿨랙 CFT30	살생물제	BCS-138	3D 문화용
쿨싱크 XT96F	살생물제	BCS-536	3D 문화용
Cultrex 3D 세포 채취 키트	바이오테크네	3448-020-케이
Matrigel (단일 재배에 선호)	코 닝	356231	3D 문화용
Lab-Tec II 챔버 # 1.5 독일 커버 글라스 시스템	날지 눙크 인터내셔널	155409 (8)	3D 문화용
Lab-Tec II 챔버 # 1.5 독일 커버 글라스 시스템	날지 눙크 인터내셔널	155379 (2)	3D 문화용
ReagentPack 하대배양 시약	론자	CC-5034	TUM622 세포 해리의 경우

【무수정유출】