RNA 추출 분석: miRNA 형질주입된 폐암 세포에서 RNA를 추출하는 방법

초록

출처: Hossian, A. K. M. N. et al., 세포 주기 및 혈관 신생을 조절하기 위한 조합 miRNA 치료 분석. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 miRNA 형질 주입된 폐암 세포에서 RNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 세포주기 및 혈관 신생을 중단하는 조합 miRNA 치료 활성을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. miR-143 및 miR-506 형질주입

주의: 설명된 실험을 수행하는 동안 라텍스 장갑, 보호 안경 및 실험실 가운을 사용하십시오. 필요한 경우 기도를 막거나 층류 공기 흐름을 방해하지 않고 캐비닛 팬을 켠 상태에서 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. 보호 유리창은 항상 제조업체에서 설명한 대로 적절한 높이로 설정하십시오.

1. 조직 배양 후드에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(배양 배지)이 보충된 DMEM/F12K 배지의 T25 cm² 플라스크/6/96 웰 플레이트에 NSCLC A549 세포를 파종하고 조직 배양 인큐베이터에서 5% CO₂와 함께 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. miR-143 및/또는 miR-506 모방체를 현탁시키거나, 100 nM의 최종 miRNA 농도에서 500 μL의 형질주입 배지 및 1.5 mL의 혈청 및 무항생제 DMEM/F12K 배지에서 siRNA를 transfection 배지(2.4 μg의 miR와 14 μL의 transfecting agent와 혼합함; 재료 표 참조)와 스크램블합니다. miRNA 양은 다른 세포 및 농도에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 적절한 접근법에는 miRNA 농도가 증가하는 세포의 transfection(즉, 50-200 nM) 및 관심 유전자의 발현 하향 조절 평가가 포함됩니다.
3. 플라스크/플레이트에서 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 한 번 세척합니다.
4. miRNA/scramble-transfecting agent complex를 추가하고 37°C에서 5% CO₂로 6시간 동안 배양합니다(플라스크 크기는 추가된 배양 부피를 정의함).
5. 배지를 4mL의 배양 배지로 교체하고 24시간 및/또는 48시간 동안 세포를 배양합니다.
6. 각 T25cm² 플라스크에 1mL의 트립신-EDTA를 첨가하여 트립신화에 의해 형질주입된 세포를 수확하고, 37°C에서 5-10분 동안 배양하고, 3mL의 배양 배지를 추가하여 세포를 수확합니다. 각 플라스크의 내용물을 15mL라고 표시된 별도의 튜브에 넣습니다. 조직 배양 후드에서 작업합니다.
7. 751 x g에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 상층액을 제거합니다.
   메모: 상등액을 제거하는 동안에는 튜브의 교반으로 인해 세포가 손실될 수 있으므로 주의가 필요합니다.
8. 1x PBS 2mL를 추가하고 751 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
9. 7단계와 8단계를 한 번 반복하여 매체와 상층액의 흔적을 제거합니다.
   메모: 이 단계에서 시료 튜브는 -80°C에서 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

2. RNA 추출

1. 70% 이소프로필 알코올과 RNAse 오염 제거 용액을 분사하여 작업 영역을 청소합니다.
2. RNA 추출은 적절한 RNA 키트를 사용하여 수행해야 합니다(재료 표 참조).
3. -80 °C에서 튜브를 제거하고 해동시킵니다. 300μL의 용해 완충액과 피펫을 위아래로 추가하여 세포막을 파괴합니다.
4. 동일한 부피의 100% 초순수 에탄올을 첨가합니다.
5. 잘 섞어 분리 컬럼에 놓습니다.
6. 11에서 16 x g 사이의 원심분리기를 30초 동안 제거하고 플로우 스루를 제거합니다.
7. 400μL의 세척 버퍼와 원심분리기를 추가하여 버퍼를 제거합니다.
8. 각 샘플에 5μL의 DNAse I와 75μL의 DNA 분해 버퍼를 추가하고 15분 동안 배양합니다.
9. 400μL의 RNA 분취 완충액으로 시료를 세척합니다.
10. RNA 세척 버퍼로 2회 세척합니다.
11. 컬럼에 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 원심분리한 다음 RNA를 수집합니다.
12. UV 분광 광도계로 총 RNA 농도를 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
A549 비소세포폐암세포(Non Small Cell Lung Cancer Cells)	증권 시세	ATCC CCL-185
Ambion 소음기 네거티브 컨트롤 No. 1 siRNA	앰비언	AM4611
has-miR-143-3p miRNA 모방	증권 시세	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA 모방	증권 시세	MCH02824
소 태아 세럼(FBS)	피셔 사이언티픽	10438026
HyClone 인산염 완충 식염수(PBS)	피셔 사이언티픽	SH30256FS
DMEM 4.5 g/L 포도당, 피루브산나트륨 제외, L-글루타민 포함	폭스바겐	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNase/ RNase-free 증류수	인비트로젠	Tel.: 10-977-015
Quick-RNA 키트	자이모 리서치	R1055
에탄올, 절대(200프루프), 분자생물학 등급,	Fisher BioReagents	BP2818500
-80 °C 냉동고	폭스바겐	VWR40086A
나노드롭	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	나노드롭 원 C
96웰 플레이트	CELLTREAT 사이언티픽	전화: 50-607-511
페니실린-스트렙토마이신 10/10	안틀란타 바이오로직스	B21210
CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	헤라셀 150i
디나아제	자이모 리서치	E1010
F-12K L-글루타민과 영양 혼합물(Kaighn's Mod.), 코닝	코 닝	45000-354
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