세포주기 분석: miRNA transfected 폐암 세포의 세포주기 조절을 연구하기 위한 접근법

초록

출처: Hossian, A. K. M. N., et al. 세포 주기 및 혈관 형성을 조절하기 위한 조합 miRNA 처리의 분석.J. Vis. 특급(2019).

miRNA 또는 microRNA는 세포주기 진행의 핵심 조절자입니다. 이 동영상은 miRNA가 세포주기 조절에 미치는 영향을 연구하기 위해 miRNA로 transfection된 폐암 세포의 유세포 분석 기반 세포주기 분석을 설명합니다. 세포주기 진행을 중단시킴으로써 증식을 억제하는 것은 암 치료를 위한 유망한 접근법이 될 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.

프로토콜

1. miR-143 및 miR-506 형질주입

주의: 설명된 실험을 수행하는 동안 라텍스 장갑, 보호 안경 및 실험실 가운을 사용하십시오. 필요한 경우 기도를 막거나 층류 공기 흐름을 방해하지 않고 캐비닛 팬을 켠 상태에서 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. 보호 유리창은 항상 제조업체에서 설명한 대로 적절한 높이로 설정하십시오.

1. 조직 배양 후드에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(배양 배지)이 보충된 DMEM/F12K 배지의 T25 cm² 플라스크/6/96 웰 플레이트에 NSCLC A549 세포를 파종하고 조직 배양 인큐베이터에서 5% CO₂와 함께 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. miR-143 및/또는 miR-506 모방체를 현탁시키거나, 100 nM의 최종 miRNA 농도에서 500 μL의 형질주입 배지 및 1.5 mL의 혈청 및 무항생제 DMEM/F12K 배지에서 siRNA를 transfection 배지(2.4 μg의 miR와 14 μL의 transfecting agent와 혼합함; 재료 표 참조)와 스크램블합니다. miRNA 양은 다른 세포 및 농도에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 적절한 접근법에는 miRNA 농도가 증가하는 세포의 transfection(즉, 50-200 nM) 및 관심 유전자의 발현 하향 조절 평가가 포함됩니다.
3. 플라스크/플레이트에서 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 한 번 세척합니다.
4. miRNA/scramble-transfecting agent complex를 추가하고 37°C에서 5% CO₂로 6시간 동안 배양합니다(플라스크 크기는 추가된 배양 부피를 정의함).
5. 배지를 4mL의 배양 배지로 교체하고 24시간 및/또는 48시간 동안 세포를 배양합니다.
6. 각 T25cm² 플라스크에 1mL의 트립신-EDTA를 첨가하여 트립신화에 의해 형질주입된 세포를 수확하고, 37°C에서 5-10분 동안 배양하고, 3mL의 배양 배지를 추가하여 세포를 수확합니다. 각 플라스크의 내용물을 15mL라고 표시된 별도의 튜브에 넣습니다. 조직 배양 후드에서 작업합니다.
7. 751 x g에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 상층액을 제거합니다.
   메모: 상등액을 제거하는 동안에는 튜브의 교반으로 인해 세포가 손실될 수 있으므로 주의가 필요합니다.
8. 1x PBS 2mL를 추가하고 751 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
9. 7단계와 8단계를 한 번 반복하여 매체와 상층액의 흔적을 제거합니다.
   참고: 이 단계에서 샘플 튜브는 -80°C에서 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

2. 세포주기 분석

1. T25 cm² 플라스크의 각 샘플에 대해 5 x 10⁵ 세포를 시드하고 섹션 1, 1-5단계에 설명된 프로토콜에 따라 transfection을 수행합니다.
2. 24시간 및 48시간 후 트립신화로 세포를 수확합니다.
3. 세포 현탁액을 15mL 멸균 튜브로 옮기고 적절하게 라벨링합니다.
4. 751 x g에서 5분 동안 원심분리기 시료를 추출하고 상층액을 버립니다.
5. 얼음처럼 차가운 1x PBS, 와류 및 원심분리기 2mL를 751 x g에서 5분 동안 추가합니다. 상등액을 버립니다.
6. 1x PBS로 세척 단계를 반복하여 잔류 매체를 제거합니다.
7. 피펫팅으로 200μL의 얼음처럼 차가운 1x PBS를 첨가하여 펠릿을 재현탁 및 분해합니다.
8. 부드럽게 와류를 치면서 70% 얼음처럼 차가운 에탄올 2mL를 튜브에 적가하여 세포를 고정합니다.
9. RT에서 30분 동안 튜브를 배양하고 튜브를 4°C에서 1시간 동안 놓습니다.
10. 4°C에서 튜브를 분리하고 751 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 얼음처럼 차가운 1x PBS, 와류 및 원심분리기 2mL를 751 x g에서 5분 동안 추가합니다. 상등액을 버립니다.
12. 프로피듐 요오드화물(50μg/mL) 및 리보뉴클레아제 A(200μg/mL)와 함께 500μL의 1x PBS를 추가합니다.
13. RT에서 30분 동안 배양하면서 샘플을 빛으로부터 보호합니다.
14. 유세포 분석기에 대한 데이터를 수집합니다. 전방 대 측면 산란(FSC 대 SSC)을 사용하여 FSC 대 SSC 밀도 그래프의 왼쪽 하단 모서리에 있는 파편과 FSC 대 SSC 밀도 그래프의 상단에서 오른쪽 상단에 있는 세포 클러스터를 제외한 세포의 주요 모집단을 선택합니다.
15. 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 주기 단계별 세포 집단을 식별하기 위해 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 4.5 g/L 포도당, 피루브산나트륨 제외, L-글루타민 포함	폭스바겐	VWRL0100-0500
소 태아 세럼 - 프리미엄	안틀란타 바이오로직스	S11150
소 태아 세럼(FBS)	피셔 사이언티픽	10438026
페니실린-스트렙토마이신 10/10	안틀란타 바이오로직스	B21210
소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A	시그마	R6513-50MG
프로피듐 요오드화물	MP 바이오케미컬 LLC	IC19545825
에탄올, 절대(200 proof), 분자 생물학 등급	Fisher BioReagents	BP2818500
CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	헤라셀 150i
A549 비소세포폐암세포(Non Small Cell Lung Cancer Cells)	증권 시세	ATCC CCL-185
96웰 플레이트	CELLTREAT 사이언티픽	전화: 50-607-511
FACS Calibur 유량계	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)
Thermo Scientific BioLite 세포 배양 처리 플라스크	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	Tel.: 12-556-009
온도 제어 원심분리기 말냥	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	ST16R
온도 제어 마이크로 원심 분리기 성냥	에펜드론프	5415R
SpectraTube 원심분리기 튜브 15ml	폭스바겐	제470224-998
모드핏 LT	Verity 소프트웨어		2.15단계: 세포주기 집단 분포 분석을 위한 대체 소프트웨어
Fisherbrand Basix 마이크로 원심분리기 튜브(표준 스냅 캡 포함)	피셔브랜드 바식스	전화 02-682-002
has-miR-143-3p miRNA 모방	증권 시세	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA 모방	증권 시세	MCH02824
F-12K 영양 혼합물(Kaighn's Mod.)과 L-글루타민	코 닝	코닝 45000-354
네거티브 80 °C 냉동고	폭스바겐	VWR40086A

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