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1. miR-143 및 miR-506 형질주입
주의: 설명된 실험을 수행하는 동안 라텍스 장갑, 보호 안경 및 실험실 가운을 사용하십시오. 필요한 경우 기도를 막거나 층류 공기 흐름을 방해하지 않고 캐비닛 팬을 켠 상태에서 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. 보호 유리창은 항상 제조업체에서 설명한 대로 적절한 높이로 설정하십시오.
- 조직 배양 후드에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(배양 배지)이 보충된 DMEM/F12K 배지의 T25 cm2 플라스크/6/96 웰 플레이트에 NSCLC A549 세포를 파종하고 조직 배양 인큐베이터에서 5% CO2와 함께 37°C에서 밤새 배양합니다.
- miR-143 및/또는 miR-506 모방체를 현탁시키거나, 100 nM의 최종 miRNA 농도에서 500 μL의 형질주입 배지 및 1.5 mL의 혈청 및 무항생제 DMEM/F12K 배지에서 siRNA를 transfection 배지(2.4 μg의 miR와 14 μL의 transfecting agent와 혼합함; 재료 표 참조)와 스크램블합니다. miRNA 양은 다른 세포 및 농도에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 적절한 접근법에는 miRNA 농도가 증가하는 세포의 transfection(즉, 50-200 nM) 및 관심 유전자의 발현 하향 조절 평가가 포함됩니다.
- 플라스크/플레이트에서 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 한 번 세척합니다.
- miRNA/scramble-transfecting agent complex를 추가하고 37°C에서 5% CO2로 6시간 동안 배양합니다(플라스크 크기는 추가된 배양 부피를 정의함).
- 배지를 4mL의 배양 배지로 교체하고 24시간 및/또는 48시간 동안 세포를 배양합니다.
2. 항체 세포주기 마이크로어레이에 의한 단백질 발현
- T25cm2 플라스크의 각 샘플에 대해 5 x 105 세포를 시딩하고 섹션 1, 1-5단계에 설명된 프로토콜에 따라 transfection을 수행합니다.
- 24시간 및 48시간 후, 트립신화(trypsinization)에 의해 세포를 수확합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 그에 따라 라벨을 부착합니다.
- 751 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
- 얼음처럼 차가운 1x PBS 2mL, 와류 및 원심분리기를 751 x g에서 5분 동안 추가합니다. 상등액을 버립니다.
- 1x PBS로 세탁 단계를 반복합니다.
- 프로테아제 억제제가 보충된 150μL의 용해 완충액을 추가합니다. 피펫을 위아래로 부드럽게 움직여 세포막을 파괴합니다.
- 용해 완충액 간섭을 방지하려면 제조업체의 용매 교환 컬럼을 사용하여 완충액 교환을 수행하여 용해 완충액을 라벨링 완충액으로 교체하십시오.
- BCA 분석으로 총 단백질을 정량화합니다.
- 70μg의 단백질 샘플을 채취하고 라벨링 버퍼를 추가하여 최종 부피 75μL를 얻습니다.
- 100μL의 디메틸포름아미드(DMF)를 1mg의 비오틴 시약(비오틴/DMF)에 추가합니다.
- 각 단백질 샘플(비오틴화된 단백질 샘플)에 3μL의 비오틴/DMF를 추가하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 35μL의 정지 시약을 첨가하고 볼텍싱으로 혼합합니다.
- RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
- 냉장고에서 마이크로어레이 슬라이드를 제거하여 사용하기 전에 1시간 동안 RT로 데워지도록 합니다.
- RT에서 45분 동안 계속 흔들면서 페트리 접시에 3% 분유 용액(제조업체에서 제공한 차단 시약)으로 슬라이드를 배양하여 비특이적 결합에 대한 차단을 수행합니다.
- ddH2O 물로 슬라이드를 세척합니다(달리 명시되지 않는 한 세척은 ddH2O로 이루어집니다).
- 세척 단계를 ~10회 반복하여 슬라이드 표면에서 차단 용액을 완전히 제거합니다. 이것은 균일하고 낮은 배경을 얻는 데 중요합니다.
- 슬라이드 표면에서 과도한 물을 제거하고 슬라이드를 건조시키지 않고 다음 단계를 진행하십시오.
- 커플링 시약에 3% 분유를 용해하여 커플링 용액을 준비합니다.
- 커플링 용액 6mL를 step12에서 이전에 준비된 비오틴화된 단백질 샘플의 전체 양에 추가합니다.
- 공급업체에서 제공한 커플링 챔버의 한 웰에 슬라이드 하나를 놓고 단백질 커플링 믹스 ~6mL를 추가합니다.
메모: 슬라이드가 단백질 커플링 혼합 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 커플링 챔버를 덮고 오비탈 쉐이커에서 지속적인 교반으로 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 페트리 접시에 옮기고 30mL의 1x 세척 버퍼를 추가합니다. 페트리 접시를 오비탈 셰이커에 넣고 10분 동안 흔든 다음 용액을 버립니다.
- 24 단계를 2x 반복합니다.
- 17단계 및 18단계에 설명된 대로 ddH2O물로 슬라이드를 광범위하게 헹구고 건조를 방지하기 위해 즉시 다음 단계로 진행합니다.
- 검출 버퍼 30mL에 Cy3-스트렙타비딘 30μL(0.5mg/mL)를 추가합니다.
- 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 Cy3-스트렙타비딘이 함유된 검출 버퍼를 30mL 추가합니다.
- 오비탈 쉐이커에서 20분 동안 빛으로부터 보호된 연속 쉐이킹으로 배양합니다.
메모: Cy-3는 형광 염료입니다. 알루미늄 호일로 덮거나 어두운 조건에서 작동하여 형광 강도를 유지하십시오.
- 24-26단계를 수행하고 부드러운 공기 흐름을 사용하여 슬라이드를 건조시키거나 슬라이드를 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 1300 x g에서 5-10분 동안 원심분리합니다.
- 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 알루미늄 호일로 덮습니다.
- 적절한 여기 및 방출 파장을 가진 마이크로어레이 스캐너에서 슬라이드를 스캔합니다. Cy3의 경우 여기 파장 피크는 ~550nm이고 방출 피크는 ~570nm입니다.
- 데이터를 분석합니다(사용된 소프트웨어는 재료 표 참조).