유세포 분석을 위한 마우스 폐 준비: 유세포 분석을 위한 폐 조직에서 세포 현탁액 생성

초록

출처: Moll, H. P., et al. PD-L1 발현 연구를 위한 신유전자 폐 선암 세포의 정교 이식. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 폐 선암 세포의 PD-L1 발현을 연구하기 위한 유세포 분석을 위한 마우스 폐 세포 현탁액의 준비에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 유세포 분석을 위한 폐 준비

1. 원하는 실험 종말점에서 케타민(체중 100mg/kg)과 자일라진(체중 10mg/kg)의 혼합물을 피하 주사하여 마우스를 진정시키고 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다.
2. 사체를 70% 에탄올에 담그고 테이프를 사용하여 해부판에 마우스를 고정합니다.
3. 복부 정중선을 절개하고 피부를 부드럽게 뒤집어 흉벽 근육과 복부 장기를 노출시킵니다. 횡격막에 구멍을 뚫고 가위로 갈비뼈를 잘라 흉강을 노출시킵니다.
4. 혈액이 빠져나갈 수 있도록 좌심실의 작은 구멍을 자른 후 27G 바늘을 사용하여 우심실을 통해 6 - 8 mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 폐를 3배 관류합니다. 폐는 피를 제거하고 완전히 하얗게 변해야 합니다.
5. 폐를 꺼내고 가위를 사용하여 엽을 작은 조각으로 다집니다. 폐 조각을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 1.5mL의 폐 분해 완충액(RPMI, 5% FCS, 150 U/mL 콜라겐분해효소 I 및 50 U/mL DNase I)에서 배양합니다.
6. 37 °C에서 30 - 60 분 동안 지속적으로 흔들면서 폐 조각을 배양합니다.
7. 70μm 세포 여과기를 통해 폐 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다. 멸균 10mL 주사기 뒷면으로 여과기를 닦고 2% FCS가 함유된 PBS 15mL로 여과기를 헹굽니다.
8. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 1mL의 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에 세포를 재현탁하고 잔류 적혈구의 용해를 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.
9. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 세포를 원심분리하고 2% FCS로 1mL의 PBS에 세포를 재현탁하고 유세포 분석을 위해 원하는 염색 프로토콜
   메모: 또는 세포를 30% FCS 및 10% DMSO를 함유하는 RPMI에 재현탁하고 추후 분석을 위해 동결 용기를 사용하여 동결할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 폐 선암 세포주			사내에서 격리
C57Bl/6 마우스			두 배경의 십자가의 F1을 사용할 수 있습니다 (8-12 주)
129S 마우스
RPMI 1640 미디엄	생명 기술	11544446
태아 송아지 세럼	생명 기술	11573397
페니실린/스트렙토마이신 용액	생명 기술	11548876
L-글루타민	생명 기술	11539876
케타솔(케타민 100mg/mL	오그리스 제약	제8-00173
자일라솔(자일라진 20mg/mL	오그리스 제약	제8-00178
무딘 집게	로보즈	RS8260
학생 아이리스 가위	정밀 과학 도구	91460-11
DNase I(RNase 프리)	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0303S
콜라겐 분해 효소 유형 I	생명 기술	17100017
ACK 용해 버퍼	론자	10-548E

) 호 ) 호 시리즈 년