면역형광 분석법: 의료용 와이어에 포획된 종양 세포를 식별하는 방법

초록

출처: Gallerani, G. et.al., 순환 종양 세포 포획을 위한 의료 와이어를 사용한 종양 세포 특성화: 면역형광 및 DNA 물고기를 기반으로 한 3D 접근 방식. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 기능화된 의료 와이어에서 캡처한 순환 종양 세포의 면역형광 염색 기술에 대해 설명합니다. 기능화된 와이어를 통해 환자의 혈류에서 직접 생체 내에서 CTC를 분리할 수 있습니다.

프로토콜

1. Immuno-DNA FISH on Wire

1. 와이어의 세포주 스파이크인(3D 지원)
   메모: 예비 설정에는 EpCAM 양성을 기반으로 부착 세포주를 정확하게 선택하는 작업이 포함됩니다. 와이어는 항 EpCAM 항체로 기능화되어 EpCAM 양성 세포만 염색됩니다.
   메모: 손상을 방지하기 위해 전선의 기능적인 부분을 만지지 마십시오.
   메모: 모든 단계는 멸균 상태에서 층류 후드 아래에서 수행해야 합니다.
   1. 4mL의 완전한 배지를 사용하여 5mL 바이알에 T75 플라스크(80% 컨플루언스)의 전체 내용물을 재현탁합니다. 단일 스파이크인의 경우 와이어에 대한 세포 접착을 최대화하기 위해 약 2,000,000개의 세포가 권장됩니다.
   2. 유리 포장에서 와이어를 제거합니다.
   3. 와이어의 기능화된 금 부분을 바이알에 담그고 와이어 스토퍼가 바이알에 방수가 되도록 합니다. 실험실 필름으로 밀봉합니다.
      메모: 와이어 스토퍼와 바이알이 올바르게 일치할 수 있도록 5mL 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.
   4. 튜브 로테이터(0-120 각도)에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 1개의 다른 깨끗한 바이알을 사용하여 3×PBS 용액에 와이어를 세 번 헹굽니다.
2. 정착 및 투과성<br /> 주의: 아세톤은 호흡기를 자극할 수 있는 가연성 물질입니다. 아세톤 내성 플라스틱 또는 유리 용기(PVC 또는 PVDF 없음)만 사용하십시오.
   메모: 화학 흄 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오.
   1. 와이어를 자연 건조하십시오.
   2. RT에서 10분 동안 아세톤 100% 용액에 와이어를 담궈 세포를 고정합니다. 5mL 튜브를 사용합니다.
      메모: 와이어 스토퍼가 정착액과 접촉하지 않아야 합니다.
   3. RT.
      에서 5분 동안 와이어를 자연 건조합니다. 메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 와이어는 -20°C에서 보관해야 합니다. 장기 보관을 위해 와이어를 포장할 때는 기능화된 팁 옆에 와이어 스토퍼를 놓고 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하면서 보관 유리관에 와이어를 조심스럽게 삽입하십시오. 보관 유리를 닫고 -20 °C에서 (수직 또는 수평으로) 보관하십시오.
3. 면역형광의 날 1
   메모: 이 단계에는 하룻밤 배양 (~ 16 시간)이 포함됩니다.
   1. 5mL 튜브를 사용하여 1× PBS 용액에 두 번 세척합니다.
   2. 5mL 튜브를 사용하여 RT에서 30분 동안 항체 희석 완충액에 와이어를 배양합니다.
   3. 데이터시트에 명시된 대로 항체 희석 완충액에서 형색소와 접합된 단클론 1차 항체를 희석하여 150μL의 항체 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, EpCAM-FITC 항체는 1:20 희석으로 사용되었습니다.
   4. p200 팁을 사용하여 다음과 같이 배양을 수행합니다: 와이어 스토퍼에서 와이어를 추출하고 팁의 더 큰 구멍을 통해 와이어를 부드럽게 삽입합니다. 작동하지 않는 끝을 먼저 삽입하고 금색 부분이 더 큰 구멍 바로 너머에 올 때까지 더 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당깁니다.
   5. 150μL의 항체 혼합물(예: 항EpCAM_FITC 항체 1:20 희석)을 팁에 부드럽게 떨어뜨립니다. 기포 형성의 위험을 방지하려면 기능화된 부분이 완전히 떨어질 때까지 와이어를 부드럽게 돌립니다.
   6. 팁의 구멍을 밀봉하십시오. 구멍 주위에 실험실 필름을 감는 것이 도움이 될 수 있습니다.
   7. 4 ° C의 어둠 속에서 밤새 (~ 16 시간) 수직으로 배양하십시오.
4. 면역형광 2일차
   1. 1×PBS에서 와이어를 2회 세척하여 항체 배양을 차단합니다.
   2. 전선 스토퍼에 전선을 다시 삽입합니다.
      메모: FISH 분석이 수행될 때까지 5mL 바이알에 4°C의 1X PBS에 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에탄올	카를로 에르바	# 414605
트윈 20	바이오 래드	# 1706531
PBS(인산염 완충 식염수)	메디카고	번호 : 09-9400-100
아세톤	시그마 알드리치	# 534064-500ML
고무 시멘트	로얄 탈렌스	# 95306500
EpCAM-FITC (클론: HEA-125)	미테니	#번호: 130-080-301
RPMI 1640	지브코	# 31870-025
XT 알크 BA	메타시스템 프로브	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		기능화된 와이어
ZEISS 형광 현미경 Axioskop	자이스
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64비트 소프트웨어	니콘
Nikon DS-QiMc 12비트 디지털 카메라	니콘	DS-치맥

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