방법 논문

miRNA 추출: 혈장 샘플에서 miRNA를 추출하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Mensah, M. et. al., MicroRNA 기반 액체 생검: 폐암 검진을 위한 혈장 miRNA 시그니처 분류기(MSC)의 경험. J. Vis. 특급 (2017).

MicroRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 조직 특이적이고 작은 비암호화 RNA이며 폐암의 조기 발견에 이상적인 후보가 될 수 있습니다. 주요 프로토콜에서는 조기 폐암 검진을 위해 환자의 혈액 샘플에서 microRNA를 분리할 것입니다.

프로토콜

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1. 플라즈마 시료 채취

  1. 스프레이 코팅된 K2EDTA가 있는 Vacutainer 튜브에 10mL의 전혈 샘플을 수집하고 실온에서 보관하십시오.
    메모: 용혈을 최소화하려면 2시간 이내에 혈장을 분리하십시오. 불특이적 miRNA 방출로 이어지는 열 쇼크 및 세포 용해를 방지하기 위해 전혈을 저온(즉, 4°C)에 보관하지 마십시오.
  2. 1시간 이내에 1,258 x g 및 4°C에서 10분 동안 1차 원심분리 단계로 혈장을 분리합니다.
  3. 혈장 상등액을 15mL 튜브로 옮기되 림프구 고리와의 접촉을 피하십시오.
  4. 1,258 x g 및 4°C에서 10분 동안 플라즈마를 두 번째로 원심분리합니다.
  5. 1mL의 혈장을 1.5mL 극저온으로 분취하여 튜브 기저부에서 혈장 분획이 수집되지 않도록 합니다.
  6. 용혈 평가를 위해 하나를 제외한 모든 부분 표본을 -80 °C에서 보관하십시오. 분자 분석은 5주 이내에 수행해야 합니다.

2. 플라즈마 총 RNA 추출

  1. 균질화 용액 mL당 20μL의 1-티오글리세롤이 있는 1-티오글리세롤/균질화(OMG) 용액을 준비합니다. 1-Thioglycerol은 점성이 있으므로 정확한 측정을 위해 조심스럽게 피펫을 사용하십시오. OMG 용액을 사용하기 전에 얼음이나 2-10 °C에서 식히십시오.
    메모: 작업 솔루션은 2-10 °C에서 1 개월 동안 안정적입니다.
  2. 바이알에 뉴클레아제가 없는 물 275μL를 첨가하여 동결건조된 DNase I를 현탁시키고 부드럽게 혼합합니다(와류가 발생하지 않음). 시각 보조 수단으로, 재구성된 DNase I에 5μL의 청색 염료를 첨가하고 용액을 nuclease-free 튜브의 일회용 부분 표본에 분주합니다. 재구성된 DNase I을 -30°C에서 -10°C에 보관하십시오.
  3. 200μL의 플라즈마에서 시작하여 200μL의 냉각 OMG 용액을 추가합니다.
  4. 와류 15-30 초는 완전한 균질화를 보장합니다. 거품이 발생하면 샘플을 얼음 위에 가라앉히십시오.
  5. 200μL의 Lysis Buffer와 25μL의 Proteinase K를 균질화된 샘플에 추가하고 20초 동안 와류를 수행합니다.
  6. 37°C로 예열된 써모믹서에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
  7. 각 샘플에 대한 카트리지를 로드합니다.amp기기의 데크 트레이에 놓고 플러거를 올바른 위치에 놓습니다.
  8. 용해물을 기기 카트리지의 적절한 위치로 옮깁니다.
  9. 5μL의 DNase I 용액을 카트리지의 적절한 위치에 추가합니다.
  10. 각 용출 튜브의 베이스에 60μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.
  11. "RSC miRNA Tissue" Method를 선택하고 자동 정제 실행을 시작합니다. 총 RNA 샘플은 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBS 1개 론자 베-17-516
20xTE 버퍼, pH 8.0 분자 프로브T1149320X 원액을 Nuclease-free 물에서 최종 농도 0,1X로 희석
뉴클레아제가 없는 물
Maxwell RSC miRNA 조직 키트 프로메가AS1460이 키트에는 균질화 용액, DNase I, Proteinase K, 용해 버퍼 및 카트리지가 포함되어 있습니다. 1-티오글리세롤의 경우 흡입 및 피부 및 눈과의 접촉을 피해야 합니다. 흄 캐비닛 아래에서 사용하십시오.
Vacutainer 안전 잠금 혈액 채취 세트 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)제367286-364815
와류 믹서 벨프 사이언티피카F202A0173
ThermoMixer T-쉐이커 유로클론A00564RNA 추출을 시작하기 전에 Thermo Mixer를 37°C로 가져옵니다
맥스웰 RSC 계기 프로메가AS4500
극저온 바이알 1.5 ml 시그마-알드리치Z359033
합니다. 호 . 시리즈

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태그

RNAProteinase KDNase 1miRNA

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