면역조직화학적 염색: 얇은 조직 절편에서 공간 정보를 얻는 방법

Abstract

출처: Baharom F. et al., Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. 특급. (2017년)

이 동영상은 기관지 내 생검에서 수지상 세포를 식별하기 위한 면역조직화학 염색 기법에 대해 설명합니다.

Protocol

1. GMA 단면화.

1. 증류수로 0.05% 암모니아 용액을 준비합니다. 유리칼과 생검을 마이크로톰에 넣습니다. 칼날이 블록 표면에 평평하게 놓이도록 나이프 홀더와 바이옵시 블록의 각도를 조정하여 바이옵시 블록을 블레이드와 조심스럽게 정렬합니다.
2. 느린 절단 속도로 마이크로톰을 사용하여 2μm 두께의 절편을 절단하고 집게를 사용하여 암모니아 물 위에 절편을 옮기고 띄웁니다. 단면을 45-90초 동안 띄워 항원을 부드럽게 회수하고 단면을 펼칠 수 있습니다.
3. 현미경 슬라이드로 절편을 픽업합니다. toluidine blue로 빠르게 염색하여 생검 조직학을 확인합니다.
4. 50°C로 설정된 핫 플레이트에서 슬라이드를 건조시키고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 500μl의 여과된 톨루이딘 블루 염색을 섹션에 적용합니다. 얼룩 가장자리에 녹색 고리가 나타나기 시작할 때까지 핫 플레이트의 부분을 따뜻하게 한 다음 물로 씻어냅니다.
5. 광학 현미경을 사용하여 생검 조직학을 확인합니다. 면역조직화학에 사용되는 절편은 손상되지 않은 얇은 판과 상피가 잘 있어야 하며, 분비선과 평활근이 가능한 한 적어야 합니다.
6. 조직학적으로 양호한 절편을 절단하고 면역조직화학 염색을 위한 폴리 L-라이신 코팅(PLL 코팅) 현미경 슬라이드로 선택합니다. 분석을 위해 각 생검에서 최소 두 개의 절편을 잘라냅니다. 최소 1시간 동안 드라이 슬라이드를 사용하십시오. 건조 후 절편을 주석 호일로 싸서 -20°C에서 최대 2주 동안 보관하거나 즉시 면역 염색할 수 있습니다.

2. GMA 포매 기관지 생검의 면역조직화학적 염색

참고: 아지드화나트륨은 독성이 있습니다. 0.1% 아지드화나트륨 용액을 흄 후드 내에서 산으로부터 멀리 준비합니다. 산과 접촉하면 독성 가스가 방출됩니다.

1. 다이아몬드 끝이 있는 펜을 사용하여 섹션 주위를 그리고 슬라이드를 염색 선반에 배열합니다.
2. 과산화효소 차단을 수행합니다. 0.1% 아지드화나트륨 용액에 0.3% 과산화수소의 과산화효소 블록 용액을 준비합니다. 과산화효소 블록 1ml를 절편에 바르고 30분 동안 배양합니다.
3. 0.05M 트리스 완충 식염수(TBS), pH 7.6의 세척 용액을 준비합니다. TBS에서 슬라이드를 3회 5분 동안 세탁합니다.
4. DMEM에서 1% BSA 블록 용액을 준비합니다. 이 작업을 미리 대량으로 수행하고 필요할 때까지 분취하고 동결하십시오. 슬라이드를 배출하고 블록 용액의 절편을 30분 동안 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다. 비특이적 결합이 여전히 발생하는 경우, 2차 항체와 동일한 종의 5% 혈청 블록으로 30분 배양 단계를 포함합니다.
5. TBS의 1차 항체(CD45 또는 CD1a)를 원하는 농도(CD45, 1:1,000으로 희석; CD1a를 1:1,00으로 희석)하여 슬라이드에 적용합니다. 섹션을 커버슬립하고 RT에서 하룻밤 동안 배양합니다.
6. TBS에서 슬라이드를 세 번 세척합니다. TBS에서 비오틴화된 2차 항체(1차 항체 숙주종, 이 경우 토끼 항-마우스 F(ab'₂)에 대한 것)을 원하는 농도(1:300 희석)로 희석하고 슬라이드에 적용합니다. RT에서 2시간 동안 배양합니다.
7. 사용 최소 30분 전에 streptavidin 비오틴-과산화효소 복합체를 준비하십시오. 모든 슬라이드를 덮을 수 있을 만큼 충분한지 확인하십시오. TBS에서 슬라이드를 세 번 세척합니다. 슬라이드에 용액을 바르고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
8. TBS에서 슬라이드를 세 번 세척합니다. 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) peroxidase 기질 용액 (제조업체의 지침에 따라 제작)을 준비합니다. 슬라이드에 바르고 20-30분 동안 또는 원하는 염색 강도가 나타날 때까지 배양합니다.
9. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 5분 동안 헹굽니다. 여과된 Mayer의 헤마톡실린 용액으로 섹션을 2분 동안 반대 염색합니다. 흐르는 수돗물로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.
10. 슬라이드를 배수하고 영구 수성 장착 매체로 섹션을 덮습니다. 건조 오븐에서 80 °C에서 슬라이드를 건조시킵니다. 슬라이드를 식힌 다음 DPX로 장착하고 커버슬립을 놓습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMA 절편
유리 현미경 슬라이드	써모피셔 사이언티픽	10143562CEF	절단 가장자리, 젖빛 끝
Poly-L-Lysine 용액	시그마-알드리치	P8920-500mL	1:10 - 작업 솔루션
초소형 절개술용 시트 유리 스트립	알카르
트윈 20	시그마-알드리치	P2287	세척액(0.1% Tween20)
LKB 7800B 나이프메이커	LKB
캡슐 스플리터	TAAB 연구소	C065 (영문
탄소강 단일 가장자리 블레이드	TAAB 연구소	나054
부
암모니아, 25%	폭스바겐	1133.1	2L에 1ml, 1:500(0.05%)
마이크로톰	라이카		라이카 RM 2165
광원	라이카		라이카 CLS 150 XE
스윙 암 스탠드가 있는 현미경	라이카		라이카 MZ6
GMA 면역조직화학
다이아몬드 팁 펜	히스톨랩	5218
과산화수소 30% 용액	아날라 노르마푸르	23619.264
아지드화나트륨	시그마-알드리치	S8032 (영어
트리스	로슈	10708976001
소금	VWR 화학 물질	제27810.295
소 혈청 알부민	밀리포어	82-045-2	Probumin BSA 진단 등급
둘베코의 변형 독수리 미디엄 (DMEM)	시그마-알드리치	D5546
Anti-human CD45 항체	바이오레전드	304002	마우스 단클론, 클론 HI30, 동형 IgG1k. 500ng/ml의 작업 농도
항인간 CD1a 항체 AbD	(주)세로테크	MCA80GA	마우스 단클론, 클론 NA1/34- HLK, 이소타입 IgG2a. 작업 농도 10μg/ml
마우스 단클론 IgG1 isotype 제어	아브캠	AB27479
마우스 단클론 IgG2a isotype 제어	다코	X094301-2
Vectastain ABC Elite 표준 키트	벡터 랩스	PK-6100
AEC (3- 아미노 -9- 에틸 카르 바졸) peroxidase 기질 연	벡터 랩스	SK-4200
메이어스 헤마톡실린	히스토랩	1820
영구 수성 장착 보통	ABD 세로테크	BUF058C
건조 오븐
DPX 영구 장착 솔루션	폭스바겐	360292F
광학 현미경	라이카		라이카 DMLB
현미경 카메라	라이카		라이카 DFC 320
해석 소프트웨어	라이카		라이카 Qwin V3