엑소좀 분리: 비소세포폐암 환자의 혈장에서 엑소좀을 분리하는 기법

초록

출처: Giallombardo, M., et al. 엑소좀 miRNA 분석: 실현 가능한 액체 생검 도구. J. Vis. 특급(2016).

혈장 분리 엑소좀은 조기 발견 및 질병 진행을 위한 바이오마커의 검출 및 추적 관찰을 위한 비침습적이고 반복 가능한 방법으로 사용할 수 있습니다. 이 동영상은 비소세포폐암 환자의 혈장 샘플에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 DNA 및 단백질 추출에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 엑소좀 분리

참고: 혈장 샘플에서 엑소좀을 분리하는 작업은 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 RNAse 처리를 추가하여 수행했습니다(이 모든 단계는 개인 및 환경 보호 장비를 착용하고 생물학적 샘플 조작에 대한 특정 법적 절차를 따라야 합니다).

1. -80 ° C에서 보관 된 각 샘플의 플라즈마 1ml를 가져 와서 얼음에 놓습니다.
2. RT에서 20분 동안 2,000 × g의 시료를 원심분리하십시오. 이 통로는 세포와 파편을 제거하기 위해 필수입니다.
3. 깨끗한 혈장이 들어있는 상층액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.
4. 새 튜브를 10,000 × g에서 상온에서 20분 동안 원심분리합니다.
5. 깨끗한 혈장이 들어있는 상층액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.
6. 상층액에 100ng/ml의 RNAse를 첨가하고 순환 RNA를 분해하기 위해 37°C에서 10분 동안 튜브를 배양합니다.
7. 처리된 모든 혈장을 새 2ml 튜브로 옮기고 0.5부피의 1x PBS를 추가합니다.
8. 용액을 혼합하기 위해 샘플을 소용돌이치십시오.
9. 0.05 부피의 Proteinase K 용액(키트에 동봉)을 샘플에 추가합니다.
10. 샘플을 볼텍스한 다음 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
11. 샘플에 0.2 부피의 엑소좀 침전 버퍼를 추가하고 inversion으로 용액을 혼합합니다.
12. 2 °C에서 8 °C에서 30 분 동안 샘플을 배양 한 다음 실온에서 5 분 동안 10,000 × g에서 샘플을 원심 분리합니다.
13. 상층액을 흡인하고 버립니다. 펠릿에는 분리된 엑소좀이 포함되어 있습니다.
14. 엑소좀을 재현탁하기 위해 선택된 완충액을 엑소좀 펠릿에 추가합니다. 버퍼 선택은 계획된 다운스트림 분석에 따라 달라지며, 이 경우 다음과 같습니다.
    1. TEM 분석을 수행하기 위해 100μl의 1x PBS를 추가합니다.
    2. RNA 추출을 위해 346.5μl의 특정 용해 완충액을 추가합니다(상용 키트에서)(주의: 화학적 위험).
    3. 웨스턴 블로팅 분석을 수행하기 위해 단백질 추출을 위한 용해 완충액 100μl(Tris-HCl 50mM, pH 7.6 - NaCl 300mM - Triton X-100 0.5% - PMSF 1mM - Leupeptin/Aprotinin 10μg/ml)를 추가합니다. (주의: 화학적 위험).
15. 재현탁된 엑소좀은 -20°C에서 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
총 엑소좀 분리 키트(혈장에서)	인비트로젠	4484450	Proteinase K 처리제 사용
리보뉴클레아제 A	시그마-알드리치	R4875-100MG
RNAspin Illustra 미니 키트 50	GE 헬스케어	제25-0500-71

호