3D DNA 물고기: 염색체에서 특정 유전자를 찾는 기술

초록

출처: Gallerani, G. et.al. 순환 종양 세포를 포획하기 위한 의료 와이어를 사용한 종양 세포의 특성화: 면역 형광 및 DNA 물고기를 기반으로 한 3D 접근 방식. J. Vis. 특급. (2017).

암 환자의 혈액에서 순환 종양 세포(CTC) 분리 및 특성화는 비침습적 액체 생검의 한 유형이며 재발 및 질병 진행과 관련이 있습니다. 이 비디오는 특정 관심 유전자를 연구하기 위해 의료용 와이어에 캡처된 CTC의 DNA FISH(Fluorescence-in-situ-hybridization) 기술을 설명합니다.

프로토콜

1. 3D DNA-FISH 2일차

주의: 기기의 고온과 습한 챔버에 특별한 주의를 기울여야 합니다.

1. 혼성화 오븐과 건열 오븐을 설정합니다(DNA-FISH 프로토콜 시작 ~ 3시간 전). 혼성화 오븐을 75°C로 설정하고 건열 오븐을 37°C로 설정하고 0.4× SSC 용액(pH = 7.0 ± 0.1)을 4°C로 냉각합니다.
   메모: FISH 버퍼의 pH 상태는 중요하며 7.0 ± 0.1이어야 합니다.
2. 얼음처럼 차가운 0.4× SSC solution.
   에서 와이어를 3번 세척합니다. 메모: 다음 절차 동안 형광 색소 광표백을 방지하기 위해 와이어를 어두운 곳에 보관하십시오.
3. 흄 찬장 아래의 어둠 속에서 10분 동안 말리십시오.
4. 소용돌이를 일으키고 프로브를 5초 동안 돌립니다.
5. 프로브 10μL를 유리 마이크로튜브에 떨어뜨립니다. 실험실 필름으로 덮으십시오.
6. 마이크로튜브를 다음과 같이 돌립니다: 마이크로튜브를 마른 흡수제로 감싸고 종이를 50mL 튜브에 넣은 다음 짧게 돌립니다.
7. 건조된 와이어를 마이크로 튜브에 조심스럽게 넣고 와이어 스토퍼를 삽입합니다. 고무 시멘트로 밀봉합니다.
   주의: 다음 두 단계는 고온과 관련이 있습니다. 보호 장갑을 착용하십시오.
8. 완전한 DNA 변성을 얻기 위해 75°C에서 8분 동안 혼성화 오븐의 어둡고 습한 챔버에 와이어를 넣습니다.
9. 습한 챔버를 37°C의 건조 가열 오븐으로 밤새 옮깁니다.

2. 3D DNA-FISH 3일차

1. 0.4× SSC 용액이 담긴 슬라이드 염색 용기를 수조에 넣고 72 °C로 설정합니다.
2. 0.4 × SSC 용액 온도가 72 ± 1 °C에 도달할 때까지 확인하십시오.
3. 두 개의 유리 비커를 준비하는데, 하나는 2× SSC + 0.05% 트윈(pH = 7.0 ± 0.1) 용액이고 두 번째는 증류수가 있는 비커입니다.
4. 건열 오븐에서 습한 챔버를 제거하고 핀셋을 사용하여 와이어 스토퍼에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거한 다음 와이어를 꺼냅니다.
   메모: 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하면서 IN-Stopper를 통해 코팅되지 않은 와이어 끝을 조심스럽게 당깁니다.
5. 와이어를 0.4× SSC 용액에 2°C에서 72분 동안 담그십시오.
6. RT에서 2초 동안 2× SSC + 0.05% 트윈 용액으로 와이어를 30초 동안 세척합니다.
7. RT에서 증류수로 와이어를 세척하십시오.
8. 흄 후드 아래의 와이어를 어둠 속에서 10분 동안 말리십시오.
9. 1×PBS 2mL에 1.43μM의 DAPI 원액을 준비합니다.
10. RT에서 어둠 속에서 1시간 동안 2mL 바이알에 DAPI 용액으로 와이어의 기능화된 팁을 배양합니다.
11. 와이어를 1×PBS로 두 번 헹구고 자연 건조합니다.

3. 3D 현미경 관찰 및 분석

1. 와이어 홀더에 와이어를 배치합니다. 팁이 커플링 지점과 일치할 때까지 특수 홀더의 진입점을 통해 기능화된 팁을 조심스럽게 삽입합니다. 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하십시오(그림 1a).
2. 현미경 스테이지에 특수 홀더를 놓습니다. 20× 렌즈를 사용하여 현미경의 초점을 조정합니다. 먼저 특수 지지대에 거칠게 초점을 맞춘 다음 DAPI 채널에서 밝게 보이는 셀을 미세하게 조정합니다.

결과

그림 1: 기능화된 와이어, ALK 분리 프로브의 개략적 배열, ALK 재배열의 예상 패턴 계획 및 특수 홀더.(a) 빨간색 상자는 와이어의 세 가지 주요 부분, 즉 기능화된 팁, 와이어 스토퍼 및 비기능화된 팁을 강조합니다. 기능화된 팁은 와이어에서 가장 섬세한 부분이며 셀 분리나 손상을 방지하기 위해 취급 중에 만져서는 안 됩니다. (b) 녹색 및 빨간색 프로브는 각각 ALK 유전자 자리의 상류 및 하류 서열에 결합합니다(왼쪽). 오른쪽에는 ALK 배열의 예시적인 패턴이 표시되어 있습니다. 정상 세포의 적색 및 녹색 공동 국소화 신호; 분리된 녹색 및 빨간색 신호는 ALK 유전자 염색체 단절(ALK 유전자의 전좌)과 하나의 녹...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트윈 20	바이오 래드	# 1706531
바이시스 20X SSC (66g)	애보트 분자 Inc.	# 30-804850	분말은 권장 사항에 따라 증류수에 재현탁됩니다
물	밀리포어(MilliPore)
DAPI, FluoroPure 등급	인비트로젠	# D21490
ZEISS 형광 현미경 Axioskop	자이스

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