포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 보존: 조직 형태학 연구 방법

초록

출처: Nagaraj A.S., et al., 진단 검사의 전제 조건으로서의 종양 절편 외식의 확립 및 분석. J. Vis. 특급. (2018년)

다음 비디오는 포르말린 고정 및 파라핀 임베딩으로 조직의 형태를 보존하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 조직 절편의 고정 및 가공

1. 배양되지 않은 0h 참조 또는 배양된 슬라이스를 PBS에 적신 여과지로 조심스럽게 들어 올립니다.
   1. 이렇게하려면 10cm 플레이트에 놓인 여과지 위에 2-3mL의 PBS를 추가합니다. 슬라이스를 여과지 위에 놓고 집게를 사용하여 여과지를 들어 올립니다.
   2. 여과지를 히스토카세트로 옮기고 조직 절편 위에 희석된 헤마톡실린 한 방울(탈이온수 중 1:1)을 추가하여 후속 처리 단계에서 절편의 위치를 시각적으로 표시합니다(그림 1D).
   3. 카세트를 닫고 4% 중성 완충 포르말린 용액으로 옮깁니다. 4 °C에서 밤새 티슈를 고정하십시오 .
      메모: 여과지 위에 슬라이스를 놓는 동안 슬라이스의 상단 부분이 위를 향하도록 하십시오. 이는 2.3단계에서 설명한 대로 절편 및 분석 중에 슬라이스의 상단, 중간 및 하단 섹션을 따르는 데 필요합니다.
2. 다음날, 카세트를 70% EtOH로 옮기고 즉시 파라핀 포매 조직 처리 단계를 진행합니다.
3. 조직 처리 전에 히스토카셋을 100% EtOH로 2x 각각 10분 동안 세척합니다. 이 경우 조직 처리를 위해 마이크로파 스테이션을 사용하십시오. 1mm 조직 두께에 사용되는 프로그램을 선택하고 설명서(https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   에 제공된 지침을 따릅니다. 메모: 다른 조직 처리 기계를 사용할 때는 얇은 조직 샘플에 적합한 프로그램을 사용하십시오.
4. 파라핀 임베딩의 경우 히스토카세트를 열고 메스를 사용하여 여과지에서 슬라이스를 조심스럽게 들어 올립니다. 여과지를 버리고 슬라이스를 액체 파라핀이 들어있는 틀에 옮깁니다.
   예를
   1. 들어 평평한 무게로 매립 몰드의 바닥에 조직을 눌러 균일한 절단을 보장합니다. 히스토카셋의 바닥 부분을 금형 위에 놓고 그 위에 액체 파라핀을 추가합니다. 차가운 페이트에서 금형을 30분 동안 식히고 파라핀 블록에서 금형을 분리합니다.
      메모: 수평 임베딩의 대안으로, 슬라이스를 수직 위치에 배치하여 종양 슬라이스를 수직으로 임베드할 수 있습니다. 수직 절편은 단일 절편에서 생존력 또는 기능적 마커 발현의 기울기를 쉽게 분석할 수 있습니다. 수평으로 포함된 슬라이스를 사용한 그래디언트 분석에는 2.2단계에서 설명한 대로 파라핀 절편이 필요합니다.

2. 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 조직의 처리 및 분석

1. 마이크로톰을 사용하여 FFPE 조직 절편 블록의 4μm 얇은 부분을 준비합니다. 절단할 때 블록의 표면이 블레이드에 대해 수평 방향이 되도록 블록의 각도를 조정하십시오. 이것은 조직 전체에 걸쳐 균일한 단면을 얻는 데 필요합니다.
2. 잠재적인 배양 유도 생존율 구배, 절편 간 세포 이동 또는 배양된 절편 간 바이오마커 발현의 구배를 캡처하려면 아래 설명과 같이 개체 슬라이드에서 각 조직 절편의 상단, 중앙 및 하단 층에서 절편을 수집합니다.
3. 파라핀이 함유된 조직 절편의 순차적인 조직 절편을 먼저 유리 슬라이드의 상부에 수집합니다. 더 깊은 조직 층의 단면을 중간으로 계속 수집한 다음 유리 슬라이드의 하단 부분을 수집합니다(그림 1E).
   메모: 유리 슬라이드에 세 개의 섹션을 수용하려면 내장된 조직 슬라이스를 둘러싼 과도한 파라핀을 잘라냅니다.
4. 절편을 37°C에서 하룻밤 동안 건조시키고 아래에 설명된 대로 H&E 염색 또는 면역조직화학을 진행합니다.
   메모: FFPE 절편을 고온에서 보관하거나 장기간 보관할 경우 항원성 손실이 발생할 수 있습니다. 파라핀 절편은 4°C에서 보관하는 것이 좋으며, IHC 분석은 절편 후 6개월 이내에 수행해야 합니다.
   1. H&E 염색의 경우, 다음과 같이 파라핀 절편을 파라핀화하고 재수화합니다: 크실렌 3x 5분, 100% EtOH 3x 1분, 96% EtOH 2x 1분, 70% EtOH 1 x 1분, 탈이온수 2x 1분.
   2. 갓 여과된 헤마톡실린 용액에 절편을 10분 동안 배양하고 흐르는 수돗물에 5분 동안 세척합니다.산성 알코올(70% EtOH에 1% HCl)에 절편을 2회 담그고 흐르는 수돗물에 5분 동안 세척한 다음 0.5% 에오신 2분 동안 배양합니다.
   3. eosin 단계에 따라 슬라이드를 알코올 및 자일렌 용액에 담궈 섹션을 탈수합니다: 96% EtOH 2x에서 15초, 100% EtOH 3x에서 30초, 크실렌 3x에서 1분. 마지막으로, 자일렌 기반 장착 매체에 섹션을 삽입합니다.

결과

그림 1: 쥐 NSCLC 종양 유래 절편 외식의 확립 및 분석을 위한 워크플로우의 개략도.(A) 절단을 위해 종양을 지닌 폐의 수집 및 준비를 설명하는 개략도. 폐엽은 쥐에서 채취하고 종양 조직은 정상 조직에서 멀리 해부합니다. 검은색 화살촉과 별표는 각각 약 4mm와 1mm의 종양을 나타냅니다. 흰색 화살촉은 표본 홀더의 표면에 접착된 폐 조직을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 종양을 똑바로 세운 상태로 유지하기 위해 정상적인 폐 지지 조직의 추가 조각을 가리킵니다. (B) 비브라톰 슬라이스 및 조직 슬라이스 수집. 흰색 화살표는 슬라이싱 방향을 나타냅니다. 차가운 HBSS + P/S를 포함하는 24웰 플레이트에 순차적인 슬라이스를 수집합니다. 절편은 배양 중 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 조직 배양 플레이트	사르슈테트	83.1802
PBS (PBS)	론자	BE17-517Q
포름알데히드	어부	F/1501/PB08
Trifold histo 카세트 용지	암 진단	DX26280
히스토 카세트	폭스바겐	Tel.: 720-2199
마이크로톰	Thermo Fischer Scientific	HM355S
라이카 VT1200 S 진동 블레이드 마이크로톰	라이카 바이오시스템즈	14048142066
H&E 염색을 위한 헤마톡실린	머 크	1.09249.0500
카운터 염색을 위한 Hematoxylin	다코	S3309 (영어
에오신	시그마	E4382
행크스 밸런스드 염 용액(HBSS)	시그마	H6648

년 )