체외 췌장 신경 가소성 분석: 건강하고 암이 있는 인간 췌장 조직 추출물에 노출된 위장관 뉴런의 변화 연구

초록

출처: Demir, I. E., et al. 췌장 신경 가소성 시뮬레이션: 체외 이중 뉴런 가소성 분석. J. Vis. 특급 (2014).

이 비디오는 건강하고 암이 있는 인간 췌장 조직 추출물에 노출된 등뿌리 신경절과 장신경총 뉴런의 형태학적 변화를 연구하기 위한 체외 신경 가소성 분석을 보여줍니다. 이 분석을 통해 신경돌기 성장, 분기 패턴 및 신경 세포 크기를 연구할 수 있습니다.

프로토콜

1. 뉴런의 격리

추출물/상층액 수집이 완료되면 뉴런 분리를 계속합니다.

1. DRG 뉴런의 경우, 참수 후 출생 후 2-12일과 DRG의 입체 현미경 해부 사이에 신생아 쥐의 경추에서 요추 DRG를 수집합니다(그림 1A). 24웰 플레이트에 충분한 DRG 뉴런을 가지려면 플레이트당 신생아 쥐 한 마리(52 DRG와 동일)의 모든 경추에서 요추 DRG를 수집합니다.
2. 마이크로 가위를 사용하여 DRG의 주변(신경) 및 중앙 돌출부(뿌리)를 잘라냅니다. 돌출부를 그대로 두면 분쇄가 방해받고 섬유아세포에 의한 배양 오염 위험이 증가합니다.
3. MP 뉴런의 경우, 소장에서 장간막을 잘라내고 소장의 혈청근층을 수동으로 조심스럽게 제거합니다(MP 분리에 대한 자세한 프로토콜은 그림 1B). MP의 경우 24-well plate.
   당 두 마리의 쥐에서 신경총을 수집합니다. 메모: 혈청근층의 찢어짐은 소장에서 성공적으로 분리되는 것을 방해하므로 찢어지지 않도록 가능한 한 부드럽게 하십시오.
4. 겐타마이신(500ml 배지 내 20mg) 및 메트로니다졸(500ml 배지 내 2.5mg)과 함께 공급되는 얼음처럼 차가운 최소 필수 배지(MEM)에서 DRG와 혈청근육층을 수집합니다.
5. DRG를 채취한 후, 콜라겐분해효소 II형이 공급되는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에서 20-30분 동안 배양합니다. MP 분리의 경우, 동물의 나이에 따라 1-3시간 사이에 콜라겐분해효소 유형으로 배양합니다(그림 1C).
6. MP의 경우 실체 현미경으로 그물 모양의 MP 조각을 수집하고 얼음처럼 차가운 MEM으로 옮깁니다.
7. 그런 다음 직경이 감소하는 주사기를 통해 DRG와 MP를 삼중 처리합니다.
   메모: 과도한 분쇄는 뉴런을 파괴할 수 있지만 신경교세포는 덜 파괴할 수 있습니다.
8. DRG 또는 MP를 포함하는 배지가 흐려지면 93.9 x g에서 5분 동안 현탁액을 원심분리하고 배지를 버리고 Neurobasal 배지(100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 0.5mM L-글루타민 및 2% B-27 보충)에 재현탁합니다.
9. 혈구계를 사용하여 세포(즉, 뉴런 및 신경교세포)의 총 수를 계산합니다.
   메모: 필요한 셀의 수는 측정 매개변수에 따라 다릅니다. 신경돌기 밀도를 정량화하기 위해서는 신경돌기 성장, 주위 크기 및 개별 뉴런의 분지 패턴을 측정하는 것보다 더 조밀한 배양이 필요하므로 더 많은 수의 세포가 필요합니다. 신경돌기 밀도 측정의 경우, 예를 들어 10,000개의 세포(뉴런+아교세포)/웰 또는 1,500개의 뉴런/웰을 사용합니다. 개별 뉴런에 대한 형태 측정을 위해 세포의 짧은(1분 길이) 트립신화와 2,500 cells/well 또는 400 neuron/well의 파딩이 권장됩니다. 한 마리의 쥐에서 얻은 세포의 일반적인 수율은 약 300,000-500,000 개입니다.
10. 전날 밤에 코팅된 13mm 커버슬립에 세포를 파종하고 웰 위에 Neurobasal 배지(100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 0.5mM L-글루타민 및 2% B-27 보충)(그림 1D).
    메모: 폴리-D-라이신(40mg/^m2) 또는 오르니틴 및 라미닌 코팅(각 1mg/ml) 코팅된 커버슬립을 사용하십시오. 세포는 poly-D-lysine에 매우 빠르게 부착되므로 많은 세포가 필요한 실험(즉, 신경돌기 밀도 측정)에 적합합니다. 라미닌에 대한 애착은 일반적으로 다소 약하지만, 라미닌은 신경돌기 증식의 강력한 촉진제입니다. 따라서 신경 분지 및 신경돌기 길이를 측정하려면 ornithine/laminin-coating을 선호합니다.
11. 세포가 밤새 우물에 부착되도록 합니다. 다음 날, 추출물이 보충된 배지를 준비합니다(최종 추출물/상등액 농도 100μg/ml).
12. 파종 배지를 흡입하고 PBS로 선택적으로 매우 부드럽게 세척한 다음 추출물/상층액이 보충된 배지를 천천히 피펫팅합니다(그림 1E).
13. 세포가 48시간 동안 자라도록 합니다.배지를 흡인하고 면역염색을 위해 4% 파라포름알데히드를 고정합니다(그림 1F).
14. 뉴런 특이적(예: 베타 III-튜불린) 및 신경교세포 특이적(예: 신경교섬유산성 단백질/GFAP) 마커를 사용하여 이중 면역형광 염색을 수행합니다(그림 1G).
15. 형태 측정의 경우 신경돌기 밀도를 측정할 수 있는 자동화 소프트웨어와 함께 CCD 카메라가 장착된 도립광 현미경을 사용합니다(표 참조).
16. 신경 세포 배양의 신경돌기 밀도는 50 μm x 50 μm 그리드를 오버레이하고 교차하는 섬유에서 측정된 제곱당 섬유 밀도를 계산하여 각 커버슬립에서 가장 밀도가 높은 4개의 다른 영역에서 200배 배율로 4-5개의 대표 현미경 사진에서 측정됩니다. 신경돌기 성장, 뉴런당 평균 가지 수, 평균 가지 길이 및 주위 크기는 신경돌기와 주위(perikaryya)를 표시하여 각 커버슬립에서 무작위로 선택된 30개의 단독 뉴런에서 측정할 수 있습니다(그림 1H).

결과

그림 1. in vitro neuroplasticity assay의 개략적인 프로토콜. 본 분석법은 갓 태어난 쥐의 등뿌리신경절(DRG)과 근장신경총(MP) 뉴런을 사용하여 췌장 조직 추출물 또는 세포 상층액이 뉴런 및 신경교세포에 미치는 영향을 연구합니다. DRG는 절제 및 소장(A, B)의 기계적 박리 후 전방 후판 절제술 및 MP 함유 혈청근육층 후에 채취합니다. 콜라겐분해효소 II형 소화 후, 뉴런은 필요한 밀도(자세한 내용은 텍스트 참조)에 파종되고 24시간(C, D) 동안 배양됩니다. 그런 다음, 갓 준비된 췌장(또는 관심 GI 기관에서) 추출물과 세포 상등액을 미리 정의된 농도(E)로 뉴런의 성장 배지에 첨가합니다. 48시간 후, 배양액은 4% 파라포름알데히드...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마-알드리치	P1149
오르니틴/라미닌	시그마-알드리치	P2533/L4544
13mm 커버슬립	머 크		24웰 플레이트에 사용
Dismembranator S	싸토리우스
항-베타-III-튜불린 항체	밀리포어	MAB1637	1:200 농도
Anti-GFAP-항체	다코	M0761	1:400 농도
RIPA 완충액 + 프로테아제 억제제			모든 공급업체
Neurobasal 배지	Gibco/생명과학	제21103-049
B-27 보충제	Gibco/생명과학	17504044	B-27의 품질은 로트 번호에 따라 달라지는 것으로 알려져 있습니다
겐타마이신/메트로니다조			모든 공급업체
최소한의 필수 매체	Gibco/생명과학	제31095-029
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	Gibco/생명과학	24020133	Ca/Mg를 함유할 때 콜라겐분해효소 활성을 향상시킵니다
콜라겐분해효소 II형	워딩턴 생화학	CLS-2	최소 200 U/mg 활성을 가진 로트 확보
트립신-EDTA 0.25%	Gibco/생명과학	25200056
파라포름알데히드 4%			모든 공급업체
AnalySIS 다큐 소프트웨어	올림푸스

(영문) 호 호 . (영어)