CRC 세포의 포스파타아제 분석: 결장직장암 세포에서 타우 단백질의 인산화 상태를 검사하는 방법

초록

출처: Huda, M. N., et al. 결장직장암 세포에서 타우 단백질의 국소화와 함께 인산화 및 미세소관 결합에 대한 분석. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 결장직장암 세포에서 인산가수분해효소 분석법으로 타우 단백질의 인산화 상태를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 인산가수분해효소는 타우 단백질에 존재하는 인산기에 작용하여 처리되지 않은 타우 단백질 샘플에 비해 SDS PAGE 겔에서 타우 단백질의 이동성을 증가시킵니다.

프로토콜

1. 인산가수분해효소 분석

1. 세포가 ~65% confluence(현미경 검사법을 사용하여 근사치)에 도달하면 세포 용해물을 처리하고, MEM 보충 배지를 제거하고 5μM, 10μM 및 30μM 커큐민 또는 25mM, 50mM 및 100mM LiCl로 무혈청 MEM을 추가합니다. 처리 후 24시간 동안 5%_CO2를 함유하는 가습 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 배양하고 1mL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어냅니다. 스크랩한 세포를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 1,800 x g로 4분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 튜브를 정기적으로 두드리면서 4°C에서 20분 동안 100μL의 완전한 RIPA 완충액에 펠릿을 현탁시켜 세포를 용해합니다. 샘플을 간단히 초음파 처리합니다. 세포를 원심분리하여 22,570 x g의 탁상형 원심분리기에서 4°C에서 20분 동안 균질화합니다. 알칼리성 인산가수분해효소 완충액에 알칼리성 인산가수분해효소가 있는 피펫을 사용하여 상등액을 다른 표지된 튜브로 옮깁니다.
   1. 대조군 및 처리된 샘플 모두에 대해 총 20μg의 단백질을 포함하는 20μL 샘플을 준비합니다. 총 단백질 20μg을 포함하는 세포 용해물의 부피를 추가한 다음 2μL 알칼리 인산가수분해효소 완충액과 10μL 알칼리성 인산가수분해효소를 추가합니다. 증류수를 추가하여 20μL를 만듭니다.
2. 샘플을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.최종 농도 50mM에서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 첨가하거나 최종 농도 10mM에서 오르토바나데이트나트륨(Na3VO₄)을 첨가하여 반응을 중지합니다. 반응은 75°C에서 5분 동안 가열하여 중단할 수도 있습니다.
3. 인산가수분해효소를 사용한 시료의 배양이 완료되기 전에 인산가수분해효소를 추가하지 않고 동일한 농도의 시료를 준비하여 인산가수분해효소 처리된 시료와 비교합니다.
4. 400mM DTT를 함유한 갓 준비된 4X SDS 젤 로딩 버퍼를 추가합니다.
5. 100°C의 열 블록에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 와류를 사용하여 샘플을 혼합합니다. 실온에서 ~10-15분 동안 식힙니다.
6. SDS-PAGE의 10% 폴리아크릴아미드 겔을 실행하기 위한 전기영동 시스템을 조립합니다.
   1. 10% 폴리아크릴아미드 겔에 웰당 10μg 단백질(13μL 샘플)을 로드합니다. 분자량 사다리를 로드합니다.
   2. 샘플을 로드한 후 전기영동 시스템의 양극과 음극을 전원에 연결하여 일정한 전압을 유지합니다. 처음에는 70V에서 20분 동안 시작하여 단백질 샘플을 스태킹 겔에서 분해 겔로 이동합니다. 그런 다음 전압을 125V로 높이고 샘플과 단백질 사다리가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다.
   3. 전기영동이 완료된 후 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 겔을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 100V에서 ~100분 동안 전송합니다.
   4. 분자량 사다리의 측면에 작은 상처를 만들어 얼룩을 표시합니다. 투명 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용하여 얼룩을 절단하십시오.
7. 실온에서 90분 동안 4% BSA 차단 버퍼로 멤브레인을 차단합니다.
8. 1차 항체 용액(anti-tau at 1:5,000)에서 4°C에서 블롯을 하룻밤 동안 배양합니다. PBST에서 각각 7분 동안 얼룩을 네 번 씻습니다.
9. 관련 2차 항체 용액(염소 항-마우스 IgG 1:5,000)을 준비하고 실온에서 90분 동안 블롯을 배양합니다. PBST로 각각 7분씩 4번 씻습니다.
10. 제조업체의 권장 사항에 따라 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 개발합니다. 투명 플라스틱 랩으로 얼룩을 덮으십시오. 관련 소프트웨어를 사용하여 화학발광을 위한 화학발광 이미징 시스템으로 이미지를 획득합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HCT 116 셀	증권 시세	CCL-247
100mm 접시	코 닝	430161
MEM (EBSS)	하이클론	SH30024.01
소 태아 세럼(FBS)	써모피셔(Gibco)	16000044	-20 °C에서 보관하십시오
Anti-Tau 13 항체	아브캠	AB19030
디티오트레이톨(DTT)	로슈	전화: 10 708 984 001	보관 온도 2–8 °C
커큐민	시그마-알드리치(Fluka)	78246	보관 온도 2–8 °C
Anti-Tau (phospho S396) 항체	아브캠	AB109390
FastAP 감열성 알칼리성 인산가수분해효소	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	EF0651	-20 °C에서 보관하십시오
증권 시세	시그마	P7626	실온에서 보관
인산가수분해효소 억제제 칵테일	세포 신호 전달	5870	4 °C에서 보관하십시오
프로테아제 억제제 칵테일	세포 신호 전달	5871	4 °C에서 보관하십시오
Goat anti-mouse IgG 2차 항체	써모피셔	A-11005	4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	어피메트릭스	75819
분자 이미저	바이오 라드	케미독 XRS+	4 °C에서 보관하십시오
RIPA 버퍼	시그마	R 0278	보관 온도 2–8 °C
트리톤 X-100	시그마-알드리치	엑스 - 100	약 25 °C에서 보관하십시오
PVDF 멤브레인	바이오 라드	Tel.: 162-0177
Goat anti-mouse IgG 2차 항체	써모피셔	A-11005	4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	어피메트릭스	75819
단백질 분석 염료 시약	바이오 라드	전화: 500-0006
음파 디스멤브레이터	피셔 사이언티픽	모델 500
마이크로리터 원심분리기	헤티히 젠트리푸겐	마이크로 200 R