Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

프로토콜

Transcriptase 반응을 역방향

70-80로 가열 블록 돌려 ° C 42 ° C. 워터 온천도이 단계에서 사용할 수 있습니다. 가열 블록을 사용하는 경우, 열이 균일되도록 물을 넣어.

1. 마중물 반응
   1. RNA 3 μg을 가지고
   2. RNase 무료 물을 13 μl로 볼륨을 조정
   3. 랜덤 hexamer primers (2mg/mL) 2.5 μl 추가
2. 잘 믹스 8 분 동안 70-80 ° C에서 알을 품다. 5 분 얼음 그런 다음, 장소.
3. : RT 칵테일 (14.5 μl / rxn) 준비
   
   

   구성 요소	음량
   배 첫 스트랜드 버퍼	6 μl
   0.1 M DTT	3 μl
   25X aminoallyl - dNTP 믹스	1.2 μl
   윗첨자 II RT (200U/μl)	2.....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP 세트 PCR 등급
Random Hexamer 프라이머		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	사후 라벨링 반응성 염료 팩
QIAquick		Qiagen	28104	PCR 정제 키트
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	완충액			1M 인산 완충액(KPO4, pH 8.5-8.7)을 제조하려면 1M K2HPO4 9.5 mL와 1M KH2PO4 0.5 ml를 혼합한다.
인산 세척 완충액	완충액			인산 세척 완충액 100 mL(5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH)를 제조하려면 1 M KPO4 pH 8.5 0.5 ml + MilliQ water 15.25 mL + 95% ethanol 84.25 mL를 혼합한다. 세척 완충액은 약간 탁할 수 있다.** 중요: 인산 세척 완충액은 매일 제조해야 한다.
인산 용출 완충액	완충액			멸균수를 사용하여 1 M KPO4, pH 8.5를 4 mM로 희석한다.
탄산나트륨 완충액				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. NaHCO3 4.2 g을 멸균수 80 mL에 녹이고 10 N NaOH로 pH를 9.0으로 조절한 후, 멸균수로 최종 부피를 100 mL로 맞춘다. 염료 결합 반응을 위한 50 mM 용액을 제조하려면 물로 1:10 희석한다. 참고: 탄산 완충액은 시간이 지남에 따라 조성이 변하므로, 2주에서 한 달마다 새로 제조한다.