Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

Protocol

Transcriptase 반응을 역방향

70-80로 가열 블록 돌려 ° C 42 ° C. 워터 온천도이 단계에서 사용할 수 있습니다. 가열 블록을 사용하는 경우, 열이 균일되도록 물을 넣어.

1. 마중물 반응
   1. RNA 3 μg을 가지고
   2. RNase 무료 물을 13 μl로 볼륨을 조정
   3. 랜덤 hexamer primers (2mg/mL) 2.5 μl 추가
2. 잘 믹스 8 분 동안 70-80 ° C에서 알을 품다. 5 분 얼음 그런 다음, 장소.
3. : RT 칵테일 (14.5 μl / rxn) 준비
   
   

   구성 요소	음량
   배 첫 스트랜드 버퍼	6 μl
   0.1 M DTT	3 μl
   25X aminoallyl - dNTP 믹스	1.2 μl
   윗첨자 II RT (200U/μl)	2.....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		시그마-알드리치	A0410	5-(3-아미노알릴)-2' deoxyuridine-5'-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP 세트 PCR 등급
무작위 헥사머 프라이머		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR 정제 키트
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			1M 인산염 완충액 (KPO4, pH 8.5-8.7) 결합 : 9.5 mL 1M K2HPO4 및 0.5 ml 1M KH2PO4
인산염 세척 완충액	완충액			100mL 인산염 세척 완충액(5mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) 혼합물: 0.5ml 1M KPO4 pH 8.5 + 15.25mL MilliQ 물 + 84.25mL 95% 에탄올. 세척 버퍼는 약간 흐릴 것입니다.** 중요: 인산염 세척 완충액은 매일 준비해야 합니다.
인산염 용출 완충	액 완충액
				4.2 g의 NaHCO3를 80 mL의 멸균 수에 용해시키고 10 N NaOH로 pH를 9.0으로 조정하십시오. 멸균수로 최대 100mL의 용량을 가져옵니다. 염료 결합 반응을 위한 50mM 용액을 만들려면 물로 1:10으로 희석합니다. 참고: 탄산염 완충액은 시간이 지남에 따라 조성을 변화시킵니다. 2주에서 한 달에 한 번씩 새로 만드십시오.