Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

Summary

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을 표시 생체내에 영상.

Abstract

두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM)를 사용하여 생체내 이미징에서 그대로 뇌 속에 살아있는 세포와의 연결 프로세스의 연구는 있습니다. 여기에 제공 기술은 CNS에 postsynaptic 흥분성의 사이트의 대부분을 나타내는 작은 구조 아르 돌기 쪽이의 추적을 허용하는 미세한 해상도 몇 시간 포인트 (만성 영상)에서 두뇌의 동일한 지역의 영상을 허용합니다. 분명 몇 시간 동안 지점 미세 외피 구조를 해결하는 능력은 시냅스 및 회로 개조의 형태학의 변화가 근본적인 메커니즘을 설명할 수 있도록 도와있는 뇌 소성의 연구에서 특히 많은 장점이 있습니다. 이 비디오 및 보조 자료에서 우리는 thinned - 해골 준비를 사용하여 손상 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 프로토콜을 보여줍니다. thinned - 두개골 준비 따라서 염증 반응의 발병을 줄일 수 두라 및 / 또는 피질에 잠재적인 손상을 피할 수 법으로서 접근 방식입니다. 이 프로토콜이 올바르게 수행되면, 그것은 분명 시간의 장기간 동안 손상 두뇌에 돌기 척추 특성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

Protocol

1. 두 광자 현미경, 뉴런은 형광 마커로 표시하는 준비를 사용하여 손상 두뇌의 뉴런을 시각화하는 데 사용됩니다. 실험 여기서 소개 우리는 계층, 5 피라미드 세포 ¹ 라벨 GFP - M 유전자 변형 마우스 라인을 사용합니다. 레이어 5 피라미드 세포는 피아의 수준 아래에 300 μm의 깊이 dendrites과 돌기 쪽이의 시각화를 허용, 표면 레이어로 돌기 프로세스를 프로젝트. 대체 접근법은 바이러스 마커를 (어리 외를 참조하십시오., 조브에 제출)를 사용하여 레이블 셀 수 있습니다.
2. 무균 수술을 70 % 에탄올과 압력솥 도구를 사용하여 작업 영역을 소독. 깨끗한 드레싱과 표면을 운영 커버.
3. IACUC 승인 절차를 사용 Avertin의 4 분의 1 분량 (0.0075 MG / ML)가 따랐다. 펜타 닐 칵테일 (;, midazolam 5 MG / kg metatomadin 0.5 MG / kg 펜타 닐 0.05 밀리그램 / kg)로 쥐를 마취 진통제와 함께 생쥐를 Pretreat, buprenorphine은 (0.5 밀리그램 / kg) (SQ) subcutaneously 관리. 꼬리 / 발가락 공략 테스트 반응에 의해 마취 비행기의 수준을 모니터링합니다.
4. 37.5에서 동물을 유지 ° C 첨부된 직장 온도계와 가열 담요를 사용합니다. ....

Discussion

두 광자 현미경을 사용하여 만성 영상은 소성 ^2-5 동안 트리거 형태학의 변화를 연구하기 위해 점점 더 인기가 기술되고 있습니다. 여기 우리는 다른 이미징 일에 그대로 마우스의 뇌에 식별 돌기 쪽이에 따라 thinned - 두개골 준비를 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 두개골은 피질에 최소한의 손상을 초래하고 두뇌 기능 ^6을 변경할 수도 있습니다 neuroinflammation 매우 낮은 수준의 결과로, 그대로 남아 있습니다. 이것은 동물이 바로 첫 번째 수술 후 나중 년 이후 reimaged 일 몇 군데 수 있습니다. 이 강력한 기술입니다뿐만 아니라 그 제한 사항이 있습니다. 두개골 창이 명확 동안 craniotomy하고 따라서 관련 glial 인증과 관련된 더 침입 창 준비, 이미지 세션의 임의의 숫자와 뇌의 반복 이미징 수 있습니다. 얇은 두개골 준비는 그러나, 마우스의 피부를 열고 닫기에 참여 수술로 인해 대부분의 세 이미지 세션으로 제한됩니다. 또한, 깊이 침투는 두개골 창

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
펜타닐 구연산염		인 하우스		펜타닐 칵테일 : 마취 칵테일; IP 투여 량 : 0.0125 ml / g 최종 칵테일 conc .: 0.05 mg / kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail : 마취 칵테일; IP 용량 : 0.0125 ml / g 최종 칵테일 conc. : 0.05 mg / kg
Midazolam HCL		In House		펜타닐 칵테일 : 마취 칵테일; IP 투여량: 0.0125 ml/g 최종 칵테일 농도: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom– thanol				Avertin 칵테일 : 마취제; IP 용량 : 0.0075 cc / g 최종 칵테일 conc : 1 %
2- 메틸 -2- 부탄올 (최종 농도 : 0.775 %)				Avertin 칵테일 : 마취제; IP 투여량: 0.0075cc/g 최종 칵테일 농도: .775%
TC-1000 생쥐		CWE, Inc.	TC-1000 마우스	체온 온도 조절
Toberadex		In House		Eye 연고
10% 염화제		Ricca Chemical Company	3120-32	얇은 두개골 제제
미세 수술 블레이드		Sable Industries	S-6400	얇은 두개골 제제
시아노아크릴레이트 404,401		록타이트	P/N 46551	얇은 두개골 준비
Cyanoacrylate 401		Loctite	P / N 40140	얇은 두개골 준비
지퍼 키커 접착제 가속기		Pacer Technology	PT-29	얇은 두개골 준비
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm 팁 직경		Fine Science Tools	19008-07	얇은 두개골 준비
Microtorque Control Box 및 Tech2000 핸드 피스		램 제품, Inc.	TECH2000ON/OFF	얇은 두개골 준비
#6-0 (0.7 미터법) 실크 봉합		Ethicon Inc.	K8894H	테이퍼 C-1
아이 드레싱 집게, 10cm, 팁 너비 0.5mm, 곡선	수술 도구	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn 가위, 8.5cm, 직선 팁, 절단 가장자리 13mm	수술 도구	Fine Science Tools	14084-08
표준 패턴 집게, 직선, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	수술 도구	Fine Science Tools	11000-12