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방법 논문

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

12.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/2078

⸱

2010년 9월 14일

 , 
1Department of Microbiology & Immunology and the Center for AIDS Health Disparities Research, Meharry Medical College

이 논문에서

요약

숙주 세포 요인은 설치 및 Kaposi의 육종 (KS)의 유지에 중요한 역할을한다. 우리는 KSHV에 감염된 DMVEC 전지 변경 숙주 세포 요소를 식별하는 방법을 설명하고, KS 종양 조직 인치 바이러스에 의해 변경 세포 유전자 소설 치료제에 대한 잠재적인 대상 (S) 역할을합니다.

초록

현재 KS 남부 아프리카에서 가장 지배 HIV / AIDS 관련 강한 악의이며, 따라서 세계. 1,2은 그것이 혈관 내피 세포의 angioproliferative 종양으로 특징이며, 흉막 유출의 lymphomas의 형태로 드문 B 세포 lymphoproliferative 질병 (화소)을 생산 그리고 multicentric 캐슬맨의 질병 중 일부 형태. KS에서 세포의 3-5만이 1~5% 적극적으로 Kaposi의 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV), KS과 관련된 etiological 에이전트 lytic 복제를 지원하는 병변, 그리고 그것은 세포 요인해야한다는 분명하다 oncogenesis 및 종양 진행의 과정에서 바이러스 요인과 상호 작용. KS 병리에 기여 6,7 식별 소설 호스트 팩터 determinants은 물론, KS의 치료를위한 소설 치료제 개발을위한 같은 종양 진행과 전이에 대한 전조 마커를 개발하기 위해 필수적입니다 dysregulated 유전자 microarray 분석에 의해 확인되면 8. 함께 비디오 내용을 우리가 KSHV 감염 후 KS 종양 조직에서 피부 microvascular 내피 세포 (DMVEC)에 변경 숙주 세포의 유전자 발현 프로그램을 식별하는 데 사용하는 방법. 9, 단백질 표현의 변화입니다 immunoblot 및 이중 레이블 immunofluorescence에 의해 확인했다. dysregulated 유전자의 transcriptional 표현의 변경은 양적 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR qRT -)에 의해 체외로 확인됩니다. 아카이브 KS 종양 조직을 이용하여 체외의 결과에 검증도 듀얼 표시 immunochemistry 및 조직 microarrays에 의해 수행됩니다. 8,10 접근은 체외에서 이후 생체내 모델 시스템의 개발을 위해 허용되는 KS 종양 조직 microenvironment에 dysregulated 유전자를 식별하기 위해 KS의 치료를위한 잠재적인 소설 치료의 발견 및 평가.

프로토콜

1. DMVEC의 KSVH 재배 및 감염

  1. BCBL - 1 세포주, 인간의 뱃속을 기반으로 림프종에서 처음을 격리가 완료 RPMI 1640 미디어 (Gibco, 그랜드 아일랜드, NY)에서 양식입니다. BCBL - 1 세포가 37, 액체 질소 제거 드라이 아이스에 운반하고, 신속하게 1 분 해동 아르 ° C. 밀도 1x10 4 셀 / ML에서 BCBL - 1 세포의 50 μL 나누어지는 50 ML / 플라스크에 10 % 태아 송아지 혈청, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충과 175cm의 flasks에 분산 RPMI 1640 미디어 500 ML에 추가됩니다 .
  2. BCBL - 1 세포의 flasks 그 다음 37 incubated 아르 ° 5 % CO 2 분위기에서 C 세포 밀도가 3x106 세포 / ML에 도착할 때까지. Lytic 사이클 바이러스 복제가 0.3 NG / ML에서 20ng / ML 나트륨 butyrate에서 TPA를 추가하여 유도합니다.
  3. 스물 네 시간 게시물 유도 세포는 Sorvall 전설 RT의 원심 분리기에서 1,500 RPM (butyrate를 제거하기 위해)에서 원심 분리로 40 ML의 볼륨 PBS pH7.4에서 두 번 씻어하고 있으며, 유도 20 NG / ML시 TPA와 함께 계속됩니다 5 백만 일 RPMI 1640.
  4. 휴대폰 무료로 바이러스는 격리되고 차등 원심 분리에 의해 집중되어 있습니다. 간단히, 세포와 세포 부스러기는 30 분 Sorvall 4 RC - 6 플러스 원심 분리기 ° C에서 10,000 RPM 처음엔 pelleted 있습니다. 바이러스를 포함한 뜨는은 25,000 rpm으로 1 시간 동안 4 ° C에서 베크맨 쿨터 옵티마 L - 90K 초원 심 분리기에 제거하고 세포 바이러스 무료 pelleted입니다.
  5. 바이러스 무료 뜨는 제거 및 바이러스 펠렛은 필요 ° C까지 동결 미디어 resuspended (10 % 디메틸 sulfoxide와 90% 소태아 혈청)과 -80에 저장됩니다.

    기본 DMVEC 세포의 KSHV 감염.
  6. 통로 레벨 2-5에서 DMVEC 세포는 37 100x20mm 조직 문화 요리 또는 챔버 슬라이드 1 X 10 5의 초기 밀도에 도금하고 있으며, (Lonza, 바젤, 스위스) 완료 EMB - 2 미디어에 유지에 ° C 5 % 분위기 2 CO. 80 % 코플루엔스에서 DMVEC은 뫄 0.01의에 감염되며 감염된 모의 (미디어 전용) 세포가 컨트롤로 사용됩니다. 신선한 미디어는 모든 이일 세포에 추가됩니다.
  7. DMVEC 세포 monolayers 및 챔버 슬라이드는 같은 스핀들 세포 형성에 의해 언급 감염의 증거를 매일 검사하고 있습니다. 스핀들 세포 형성의 첫 번째 로그 인한 후 (7-14일) 우리는 미디어 변경을 중단. 그러나, 새로운 미디어를 제공하지 않고 15-21일 초과하는 긴 배양 시간은 문화 접시를 죽어 또는 해제 리프팅 세포에서 발생 DMVEC 세포의 무결성을 손상하실 수 있습니다.
  8. 감염 기간 동안 최대한의 가늘고의 시점에서, 세포 monolayers는 단백질이나 RNA 추출을위한 세포 펠렛의 준비를 위해 수확하고 있습니다. 챔버 슬라이드에 감염된 DMVEC 전지는 미리 예열 PBS 산도 7.4 1 ML / 창문 두 번 세탁하고 있습니다. 챔버 슬라이드에 세포 PBS 산도 7.4과 2X를 세척 후 수확하고 있습니다. 그들 챔버 스를 제거하고 immunofluorescent 얼룩 (IFA)에 필요한 때까지 -20 ° C에서 개최 100 % 메탄올에 슬라이드를 삽입하기 전에 완전히 건조 수있었습니다.

2. 모크 및 KSHV 감염된 DMVEC에서 총 RNA의 분리 및 Cdna 생산

  1. 총 RNA는 Qiagen RNesay 미니 키트 (Qiagen, 발렌시아, CA)를 사용하여 KSHV에 감염된 DMVEC 및 모의 감염된 세포에서 추출됩니다. 교양 세포가 RNA 분리에 사용되는 소스하는 경우 동물 조직을 처리를 위해 제조 업체의 프로토콜은, 균질 단계없이 근무하지만됩니다.
  2. 설명서의 부록에있는 제조 업체의 권고에 의하면, Qiagen RNA 무료 DNAse 키트를 사용하여 열을 DNAseI와 RNA 치료를 제공 옵션을 선택합니다. DNAaseI는 RNA의 준비로부터 오염이나 바이러스 게놈 DNA를 방해합니다. DNAseI 치료는 RT - PCR, qRT - PCR과 microarray 분석을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램에 중요합니다.
  3. RNA는 열을에게 제조 업체에서 제안 하나 이상의 더 많은 시간을 centrifuging에 의해 제거하는 세척 버퍼의 지시 및 잔여 에탄올에 따라 씻어입니다. 잔여 에탄올은 용출 후 RNA의 순도를 타협.
  4. RNA가 칼럼에서 eluted되기 전에 최종 세척 후 추가 원심 분리 단계가 수행됩니다. RNA는 RNAse 무료로 물 30 μL와 컬럼에서 eluted 있습니다. RNA는 다음 Eppendorf AG - 6131 바이오 광도계에 대한 계량 및 순도에 대한 분석입니다. 광학 밀도 비율 (280분의 260 NM)는 고순도의 RNA에 대한 일반적인 between1.8 - 2.0 있어야합니다.
  5. microarray 분석을 위해, RNA는 RIN 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 애질런트 2100 Bioanalyzer에 분석이다. bioanalyzer에 대한 분석은 10-10에서 RNA 무결성 번호 (RIN)을 제공, 7-10에서 그러나 RIN 번호는 microarray 또는 qRT - PCR 분석을위한 일관성 있고보다 안정적인 결과를 얻을 수 입증했습니다. RNA 이솔라 평균 RIN 번호우리 손에 Qiagen RNAeasy 키트 테드 7.5-9에서 범위.
  6. RNA의 Quantitation은 기둥에서 10mM 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 7.6의 99 μL에 eluted RNA 1 μL를 추가하여 얻을 수 있습니다. RNA와 버퍼는 피펫과 혼합하여 Eppendorf 바이오 광도계와 분광 분석을위한 깨끗한 쿠베트에 추가됩니다.
  7. 각 시료의 1 마이크로 그램의 메신저 RNA는 고용량 cDNA 역방향 전송 키트 (응용 Biosystems, 포스터 시티, CA.)으로 전송을 반대하기 전에, 제조 업체에서 제공하는 임의 hexamers를 사용하여 준비하는 것입니다.


    cDNA 합성

  8. 종합 단일 우리는 제조 업체의 지시에 따라 적용 Biosystems에서 대용량 cDNA 역방향 전송 키트를 사용하여 진행 총 RNA로부터 cDNA 좌초.
  9. 시약의 2X 마스터 믹스가 만든 10 μL의 볼륨에서 RNA의 0.5-1 μg는 2X 마스터 시약 믹스 10 μL에 추가됩니다. 결과 1X 솔루션은 부드럽게 혼합 및 역방향 녹음은 제조 업체의 지침에 따라 BIORAD MJ 미니 - themal 자전거 타는 사람에 수행됩니다.
  10. 최대 총 RNA의 두 마이크로 그램을 20 μL 반응마다 사용할 수 있습니다. cDNA는 Eppendorf AG - 6131 바이오 광도계로 260 nm의에서 quantitated하고, -80에 저장됩니다 ° C까지 qRT - PCR에 필요한.

3. 모크 및 KSHV 감염된 DMVEC 셀의 Microarray 비교 분석

우리 연구실은 유료에 대한 서비스 기준으로 밴더빌트 대학 메디컬 센터 Microarray 공유 리소스 핵심 시설에 microarray 분석을 수행합니다. 우리는 감염 제어 세포를 조롱 KSHV 감염 DMVEC 세포에서 유전자의 transcriptional dysregulation에 대한 출력 파일을 비교합니다. angiogenesis, 세포 증식과 관련이 있거나 전이성 생체를 나타내는 것을 KSHV 감염 세포 Transcriptional dysregulated 유전자는 체외 실시간 PCR, 서양 blots, 듀얼 IFA를 사용하여 KSHV 감염 DMVEC 세포를 사용하여 확인되며 결과는 보관 KS 종양의 발견에 비교 조직.

4. 모크 및 KSHV에 감염된 DMVEC에서 발견 정량 알티 PCR Transcriptional 분석 Dysregulated 진스

  1. 실시간 PCR은 리버스 정화 RNA 샘플에서 발생하고 MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 탐지 시스템 (바이오 - 래드 연구소, 헤라클레스, CA)를 사용하여 cDNA 생성 transcriptase와를 사용하여 96 자 광학 접시 (소렌손 Bioscience 주식 회사)에서 수행됩니다 25 μL 반응 볼륨. 이 절차는 객실에있는 수도 관계없는 DNA / cDNA하여 가능한 오염을 방지하기 위해 생물 학적 안전 캐비넷에서 이루어집니다.
  2. 마스터 믹스는의 농도에서 SYBR 그린 Supermix (바이오 래드 연구소, 헤라클레스, CA) 앞으로 선택과 관심의 각 유전자에 대한 역방향 primers를 사용하여 각 프라이머 세트 1.5 ML 튜브 (제조 업체의 지시에 따라)에 준비가되어 있습니다 RNAase DNAase 무료 H 2 O.에서 만들어진 잘 당 250 NM, 각 예제는 세중의에 완료해야합니다.
  3. 숙주 세포의 유전자에 대해 qRT - PCR을 위해 뇌관 시퀀스는 매우 KSHV 감염 DMVEC 셀 및 KS의 종양에 표시됩니다 핵 항원을 연관된 바이러스 대기입니다 KSHV LANA을위한 프라이머 시퀀스를 포함합니다.
  4. 10 NG / 모의 감염 KSHV 감염 DMVEC 세포에서 UL 주식 cDNAs는 RNAase DNAase 무료 H 2 O를 사용 1시 3분 희석되며이 희석의 3μL은 각 잘에 추가됩니다. cDNA에 대한 제어 웰스 대체 물​​.
  5. 96 잘 접시는 광학 씰링 테이프 (바이오 래드 연구소)와 봉인 부드럽게 혼합과 우물의 바닥에 반응 혼합물을 수집하기 위해 1000 RPM, 상온에서 2 분 centrifuged입니다. 바이오 래드 MyiQ 탐지 시스템 및 램프가 실행을 시작하기 전에 10 분 워밍업 기간 동안 수 있도록 이런 시간에 설정되어 있습니다.
  6. centrifuged 96 자 번호판이 다음 바이오 - 래드 M IQ 단일 색상 실시간 PCR 탐지 시스템에 넣고, 사이클 시퀀스의 프로그램 입력 및 저장하고, 실행 시작했다.
  7. 다음과 같이 자전거 순서는 : 3 분 95 ° C, 95 ° 15 초 동안 C, 60 ° 1 분 C, 95 ° 1 분 C, 55 ° 1 분, 55 ° C 30 초위한 C 81 사이클 총. 용융 곡선은 프라이머의 효율성을 수표로이 프로그램에 포함되어 있습니다. GAPDH의 프라이머 세트는 증폭하고, 정상화를 위해 포함됩니다.
  8. 데이터 분석은 바이오 - 래드 iQ5 광학 시스템 소프트웨어 버전 2와 함께 이루어집니다.

5. KSHV 감염된 DMVEC 셀의 듀얼 라벨 Immunofluorescence 분석

  1. 모두 합류 감염과 감염되지 않은 DMVEC을 포함한 상공 회의소 슬라이드가 (챔버에서 제거) PBS 산도 7.4로 두 번 씻어 있으며, 공기가 건조하고, 10 분 -20 ° C 미리 차게 절대 메탄올로 고정하고 -20 ° C. 개최
  2. 세포와 슬라이드 회 아르실내 공기는 15 분 동안 건조하고, 5 분 트리스 호수 (0.05M 트리스의 산도 7.4)이있는 얼음에 코플린 병으로 배치. 세포 다음 37에서 1 시간 동안 incubated 아르 ° PBS 산도 7.4에서 1시 50분 희석 (벡터 연구소 버링게임, CA) 플러스 염소 polyclonal 항체 (1 KSHV라나 단클론 항체의 혼합물과 humidified 챔버에 C : KSHV 감염 DMVEC 세포를 사용하여 microarray dyregulated 수있는 호스트 인자 단백질에 대한 PBS 산도 7.4 100 희석).
  3. 세포는 다음 트리스 호수 (세포가 건조하도록 절대)와 배 세탁 후로 복합 rhodamine 빨간 X와 당나귀 방지 염소 항체와 복합 보조 당나귀 안티 - 마우스 IgG 항체의 혼합물로 30 분 incubated 아르 FITC (잭슨 ImmunoResearch, 웨스트 그로브, PA), PBS에서 1:100 희석에서 둘 다.
  4. 세포는 나중에 코플린 병의 트리스 호수에 배 세탁하고 슬라이드 아직 습기가있는 반면, 슬라이드는 1.5 g / ML DAPI와 coverslip을 포함 Vectashield 설치 미디어 (벡터 연구소 버링게임, CA)를 탑재하고 있습니다.
  5. 형광은 관찰과 니콘 TE 2000 년대 형광 현미경으로 사진 이미지는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라와 함께 장착됩니다. 사진은 200x 총 확대를위한 20x 목표를 사용하여 촬영하고 있습니다.
  6. DAPI (200x)에 사용된 것과 같은 배율에서 별도 사진은 rhodamine 위해 녹색 필터와 FITC에 대한 푸른 필터와 usinge의 UV 조명을 촬영하고 있습니다. 이미지는 나중에 니콘의 프리웨어 소프트웨어를 사용하여 병합됩니다.

6. KSHV라나와 내피 세포의 마커 Pecam-1/cd31에 대한 KS 조직 및 KS 조직 Microarrays에 듀얼 라벨 Immunohistochemistry

  1. 듀얼 표시 immunohistochemistry은 KSHV라나와 바이러스 감염 후 변경하는 것으로 그 숙주 세포의 단백질에 대한 DAKO strepavidin ABC의 듀엣 얼룩 키트와 함께 수행됩니다. IHC는 포르말린에 고정 보관 AIDS - KS 조직에서 수행하고, 파라핀에 모두 담겨있다.
  2. 다섯 미크론 섹션은 마이크로톰로 절단 사전 immunostaining에 chemate 슬라이드에 표시됩니다.
  3. 파라핀 포함된 슬라이드는 퓸 후드 아래에 10 분 크실렌에 deparaffinzed, 그리고 세포 100 %, 95 %, 5 분마다 70 %의 등급 에탄올 시리즈 수산화입니다. 슬라이드는 다음 항원 unmasking (또한 항원 검색이라고도 함) 이전에 10 분 동안 물에 배치됩니다.
  4. immunostaining 들어, 항원 unmasking은 15 분 동안 95 ° C 50 MM의 구연 산염의 산도 6.0 버퍼에 전자렌지에 수행됩니다. 간단히, 세포가 다음 즉시 상온에서 개최 증류수에 배치, 15 분 동안 95 ° C의 구연 산염 버퍼에 빠져들 아르가 포함된 슬라이드.
  5. 내생 퍼옥시데이즈의 담금질은 담금질 솔루션 30 분 슬라이드를 잠복기에 의해 수행됩니다. 간단히, 50 ML 원뿔 관에 95 % 에탄올 47 ML을 추가, 11.2 ML PBS 산도 7.4 60 ML 총 3 % 과산화수소의 1.8 ML를 추가합니다.
    칭 솔루션은 사용하기 직전 이루어집니다.
  6. 세포는 다음 오분 실온에서 각각 PBS 산도 7.4의 3 배 세탁 있습니다. 차단 솔루션은 (95 % 에탄올의 12.5 ML 정상 염소 혈청 1.4 ML 140 MG 소 혈청 알부민, 2 방울 트윈 20) 항체의 특이 현상이 바인딩을 방지하기 위해 준비가되어 있습니다. 사용하기 전에 얼음 놓습니다. (이 차단 솔루션 ° C와 최대 1 주일 4에 저장할 수 있습니다.)
  7. 솔루션을 차단하는 것은 슬라이드 표본에 추가되고 다음 파라핀의 스트립 (시편 밖으로 건조하지 않도록)으로 덮여과 humidified 챔버에 위치하고 실온에서 1 시간 동안 incubated입니다.
  8. 바이러스 항원에 대한 기본 단클론 항체 또는 polyclonal는 1시 50분 희석에 솔루션을 차단에 준비 피펫과 혼합하여 필요한까지 얼음에 위치합니다. 항체 용액 50 ~ 100 μL은 표본의 크기와 슬라이드의 숫자에 따라 조직 표본 당 필요한 것입니다.
  9. 바로 부화 후 차단 솔루션은 슬라이드를 떨면서하고 기본 항체의 50-100 μL 그 다음 파라핀의 스트립으로 덮여있는 조직 표본에 추가됩니다. 표본은 상온에서 humidified 챔버에 1~2시간에 대한 incubated 수 있습니다.
  10. 표본을 포함하는 슬라이드 다음 PBS 산도 7.4의 각 PBS 산도 7.4에서 1:100 희석에서 보조 biotinylated 염소 안티 - 마우스 항체를 추가하고, 30 실온에서 humidified 챔버에 incubated하는 5 분 동안 3 배 세척 있습니다 - 45분.
  11. 약 30 분 사용하기 전에, PBS pH를 7.4에서 복합 - strepavidin 퍼옥시데이즈가 준비됩니다. DAKO의 Cytomation의 듀엣 키트를 사용하여 솔루션을 50 μL를 추가 PBS 산도 7.4, 소용돌이, 5 ML하고 다음 솔루션 B의 50 μL를 추가하고 다시 섞는다.
  12. 전체에서 6.10 단계에서 항체 부화 후, 슬라이드는 PBS 산도 7.4의 3 배 씻은 후 신선한 PR 아르epared 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 - strepavidin 솔루션은 humidified 챔버에 30-45분에 추가하고 실온에서 incubated입니다.
  13. 부화 후, 슬라이드는 실온에서 PBS 산도 7.4의 3 배 세탁 있습니다. 세탁하기 전에 5 분, 3, 3 - diamino - benzidine (DAB, 시그마) 기판 솔루션 (PBS 산도 7.4, 3 % 과산화수소 25 μL, 1 DAB 타블렛 20 ML) 준비 완료됩니다. DAB 태블릿이 완전히 용해되면 갈색 색깔 솔루션은 0.45 마이크론 주사기 필터를 통해 필터링됩니다. 감염된 세포에서 KSHV라나 최종 세척 및 색상 개발은 니콘 이클립스 E200 현미경을 사용하여 브라이트 조명에 따라 실시간으로 관찰 후 필터링 DAB 솔루션은 다음 표본에 추가됩니다. 원하는 색상의 개발 달성되면, 반응은 5 분 동안 증류수에 부화하여 침묵이다.
  14. 이중 표시 IHC 들어, 물속에 부화 후 표본을 포함하는 슬라이드는 항원 검색 단계 (6.4)에서 시작 두 번째 시간 IHC 프로토콜을 통해 부착 할 것입니다. 그러나의 퍼옥시데이즈 기판 단계 (6.11)에서 프로토콜 변경은 대신 양고추냉이 퍼옥시데이즈의 복합 - strepavidin, 알칼리 인산 분해 효소 strepavidin 공액가 등장합니다
  15. 두 번째 라벨은 위에 설명된대로 전자 레인지에 추가 항원 검색 단계 플러스 (벡터 연구소 버링게임, CA) dysregulated 수있는 세포 단백질에 대한 단클론 항체와 두 번째 immunostaining에 의해 이루어진다. 전지는 연속적으로 씻어 후 1:500 희석에서 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - strepavidin 공액 (벡터 연구소 버링게임, CA)에 의해 다음 1:100 희석에서 biotinylated IgG 항체 염소 anti-mouse/rabbit (DAKO)와 incubated 있습니다. 색상 개발은 제조 업체의 지시에 따라 벡터 레드 알칼리성 인산 기판 키트 (벡터 연구소 버링게임, CA)를 사용하여 기판 벡터 빨간색과 잠복기 세포에 의해 이루어진다. 카운터 얼룩이 원하는 경우 orecin 또는 hematoxylin과 함께 수행할 수 있습니다. 조직 표본은 다음 영구적으로 커버 유리 장착 permount 미디어 탑재하고 있습니다. 이미지는 CCD 카메라와 마운트 니콘 TE - 2000 년대의 현미경으로 브라이트 조명 아래에서 촬영하고 있습니다.

7. DMVEC 세포의 아데노 바이러스 전달에 의해 유전자 전달

  1. 일반 DMVEC 세포는 챔버 EBM - 2 완성 미디어 당 밀도가 2.5 X10 5 세포의 도금에서 챔버 슬라이드에서 재배하고 있습니다.
  2. DMVEC 세포는 80 % 합류 (3~5일 복용)하는 후 5 UL / titer 1X에서 아데노 바이러스 표현 EGFP의 챔버 슬라이드 창 10 10 입자 / ML.에 재배되는
  3. 아데노 바이러스가 추가로 DMVEC 셀 문화를 라이브는 바이러스를 추가한 후 EGFP 형광 18 시간 동안 조사했다.
  4. 개별 위상 및 형광 사진은 200X의 전체 배율에서 촬영 및 CCD 카메라와 마운트 니콘 TE 2000 년대 형광 현미경에 합병되었다.

8. 대표 결과

그림 1
그림 1. Lonza 사의 기본 DMVEC 세포는 EBM - 2 미디어에 유지되었으며 감염 DMVEC 세포 monolayers 매일 검사하는 동안 뫄 0.01니다.에 BCBL - 1 바이러스에 감염되었습니다. 10 일 게시물 감염 모의 감염된 세포가 게재 조약돌 같은 형태학 및 KSHV 감염 세포 스핀들 모양의 내피 세포의 스핀들 셀 타입 형태 특성은 KS 종양 조직에서 KSHV 감염 발견 전시. 사진은 100X의 전체 배율에서 CCD 카메라와 마운트 니콘 TE 2000 년대의 현미경으로 찍은.

그림 2
그림 2. 듀얼 표시 간접 immunofluorescence 얼룩 10 일 게시물 감염에서 KSHV 감염 DMVEC 세포에서 수행되었다. 감염된 세포 KSHV라나 단클론 항체와 KSHV 감염 후 변경될 것으로 특정 숙주 세포 단백질에 염소 polyclonal 항체와 이중 스테인드되었습니다. 보조 당나귀 안티 - 마우스와 rhodamine 및 FITC에 복합 당나귀 방지 염소 항체의 혼합물이 추가되었습니다. 셀은 CCD 카메라가 장착되어 니콘 TE2000S 형광 현미경으로 조사되었다. DAPI로 장착 미디어는 핵을 시각화하는 데 사용되었다. 모든 사진은 200x 총 배율에서 찍은. 핵에 지역화된 바이러스라나 단​​백질을 (rhodamine 스테인드) 표현에 감염된 세포는 세포질에 지역화된 숙주 세포 특정 단백질 (FITC 스테인드)의 감소 표현을 보여줍니다.

그림 3
그림 3. 라나와 PECAM - 1 / CD31에 대한 KS 종양 조직에서 IHC. AIDS KS 종양 조직은 KSHV라나 PECAM - 1 / C에 대한 단일 및 이중 레이블 IHC 물들어되었습니다D31. A)라나 단클론 항체와 KS 조직 스테인드를 표시하고 hematoxylin과 counterstained. LANA 긍정적인 세포가 흰색 화살표에 의해 식별됩니다. B). KS 조직 PECAMI/CD31에 대한 단클론 항체와 스테인드 및 얼룩 흰색 화살표가 그려져 혈관 주위 내피에만 나타납니다. C) CD31 양성 세포 얼룩에 대한 LANA 흰색을 위해 검은색 화살표가 그려져 LANA (벡터 빨간색)과 CD31 (브라운)에 대한 KS 조직 듀얼 얼룩을 표시합니다. D) 패널에 대한 낮은 패널 C. 브라이트 이미지에 동일한 슬라이드에서 지역의 배율 600x AC 총 배율에서 니콘 TE2000S 현미경에서 촬영되었으며 200x를 표시 D.

그림 4
그림 4. qRT - PCR 10 일 게시 감염 KSHV라나 시간적 표현이 감염 제어 세포를 조롱에 비해. KSHV 감염 DMVEC 세포에 대한 모든 값이 GAPDH에 정상화되었다. 모의 감염된 세포에서 LANA cDNA 증폭에 대한 증거가 없었다.

그림 5
그림 5. KS 종양 조직 microarrays. 조직 microarray (TMA)는 하나의 슬라이드에서 못하였 느니라 0.6 mm 조직 코어를 나타냅니다. 각 조직 코어는 다른 환자의 KS 종양 표본을 나타냅니다. TMA는 오하이오 주립 대학에서 레오나 에어즈 MD에서 에이즈 암 스피스먼 자원 (ASCR)를 통해 제공되었다. 파라핀이 일치 정상과 긍정적인 통제 조직과 함께 KS 종양 조직을 임베디드은 유리 슬라이드에 배치했다. KS 조직 표본은 입, 피부, 부드러운 미각, 혀, 목 대중에서 찍은. 모든 환자는 HIV 양성했다.

그림 6
그림 6. 조직 microarrays은 immunohistochemistry으로 KSHV라나 스테인드되었으며 브라이트 현미경에 의해 분석되었다.라나 컬러 개발 퍼옥시데이즈 기판으로 DAB와 함께 수행하고 LANA 긍정적인 세포가 강렬한 갈색 얼룩 패턴에 의해 시각 있었어요. 바이러스성 부담 및 스핀들 세포 지역의 다른 양의 볼 수 있습니다. A)은 종양의 정의 지역에 초점 바이러스 감염을 나타냅니다. B) 약 현재 스핀들 세포의 개수와 상관되는 높은 바이러스 부담 전파 감염을 나타냅니다. 스테인드 조직 코어는 200x 배율에서 관찰되었다.

그림 7
그림 7. 물론 당 2.5 X10 5 세포의 밀도에 EBM - 2 완성 미디어 재배 DMVEC 세포 1.0X10 10 titer에서 아데노 바이러스 5 μL와 transduced되었습니다. 세포 EGFP 형광 18시간 게시물 전달에 대해 검사했다. 위상 및 형광 이미지를 모두 200X 총 배율에서 니콘 TE 2000 년대 현미경에서 찍은. 기본 DMVEC 세포의 Transfection은 우리가 기본 DMVEC 매우 효율적으로 fibulin - 2 및 galetin - 3를 제공할 수 있도록 문제 때문에 우리가 확인된 바이러스 벡터 것으로 입증되었습니다. 우리는 EGFP을 표현하는 아데노 바이러스 효율적으로 기본 DMVEC을 transduce 수있다는 사실을 발견했습니다. 우리는 또한 우리가 Lentigen 회사에서 얻은 lentiviral 벡터 기본 DMVEC 세포를 (데이터가 표시되지 않음) transducing 동일하게 효율적인 것으로 나타났습니다.

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토론

이 보고서에 사용된 방법론은 실험 설정의 다양한 수행할 수 있습니다. 그들은 특별한 장비 또는 핵심 시설에 대한 액세스를 필요로합니다. biosaftey 수준 3 (BSL - 3) 시설의 사용을 요구할 수 있습니다 KSHV와 같은 전염성 바이러스성 병원체를 포함한 실험을 수행할 때 적절한주의가 이동해야합니다. 조직 인수도 해당 기관 검토 보드 (IRBs)에 의해 승인을 받아야합니다.

이러한 방법은 함께 체외에서 표현에 dysregulated 및 생체내뿐만 아니라 변경된 유전자 발현 프로파일의 검증 내피 세포의 유전자 전달을위한 전략에 대해 정의된 메서드를 제공합니다 유전자를 식별을위한 기반을 제공할 수 있습니다. 함께 찍은 이러한 연구 결과는 KSHV 감염에 의해 그리고 이후 구체적인 바이러스 유전자에 의해 영향을 생화 학적 경로를 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다. KSHV 같은 종양 발생 바이러스가 특정 분자 경로를...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 그의 조언이 원고의 검토를 위해 제임스 EK 힐드레스, 메해리 의료 대학, 감사합니다. 우리는 또한 원고의 편집 다이아나 Marver 감사합니다. 에이즈 건강 불균형 연구 센터, NIH 그랜트 5U54 RR019192 - 05,, 임상 연구 메해리 센터, NIH 그랜트 P20RR011792,이 작품은 에이즈 연구 메해리 밴더빌트 센터 (NIH 그랜트 P30 AI054999 - 05)에 의해 지원되었으며 NIH에 의해 부여 P01 CA113239. DJA는 부분적으로 에이즈 연구 밴더빌트 - 메해리 센터 (CFAR) 및 임상 연구에 대한 메해리 센터 (CRC)에서 파일럿 부여에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640Invitrogen05-0001DJ
TPASigma-AldrichP1585
PBS pH 7.4Invitrogen10010-023
Sodium butyrateSigma-Aldrich19364 (FLUKA)
EBM-2 배지Lonza Inc.CC-3156+ bullet kits 보충제
DMVEC 세포 (HMVEC)Lonza Inc.CC2543
태아 송아지 혈청HycloneSH30066.03
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15140-122
챔버 슬라이드Nalge Nunc international154461
KSHV LANA 단클론항체Vector LaboratoriesVP-H9131:50 희석/IFA
Galectin-3 염소 다클론항체R&D SystemsAF1154
Donkey-anti-goat FITCJackson ImmunoResearch705-095-1
Donkey-anti-goat RhoJackson ImmunoResearch705-295-0031:100 희석/IFA
봉입제Vector LaboratoriesH 1500DAPI 포함 Vectashield
BCA 단백질 분석 키트Pierce, Thermo Scientific23235
니트로셀룰로스Bio-Rad161-0112
Donkey-anti-goat-conj.Santa Cruz Biotechnology, Inc.SC 2020
Western 기질Pierce, Thermo Scientific34075
Biotin-rabbit-anti goatDako305-065-045
AP-Strepavidin 접합체DakoK 0492 (키트)
RNase DNase Free SetQiagen79254
MJ Mini CyclerBio-RadPTC-1148C
바이오 광도계Eppendorf952000006
RC 6 Plus 원심분리기Sorvall, Thermo Scientific46910
Coulter Optima L-90K 초원심분리기Beckman Coulter Inc.392052
MYiQ iCycler Real Time PCR 검출 시스템Bio-Rad170-9770
TE 2000S 형광 현미경Nikon InstrumentsTE2000S
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938C
Eclipse E 200Nikon InstrumentsE 200
Sorvall Legend RT 원심분리기Thermo Fisher Scientific, Inc.75004377

참고문헌

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  3. Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
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  9. Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
  10. Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).

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