Bicyclus anynana의 pupal 날개 조직에서 유전자 발현을 조사하기 위해, 우리는 riboprobes를 사용하여 현장 hybridizations에 대한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 다른 Lepidopteran 종의 pupal 날개에 사용하기 위해이 프로토콜을 더욱 최적화에 대한 지침을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기서 우리는, 비디오 형식, riboprobes를 사용하여 나비 Bicyclus anynana의 pupal 날개의 현장 hybridizations에 대한 프로토콜을 제시한다. 현장 hybridizations에서 발달 생물학의 의지는 전사 수준에서 조직 개발에 유전자 표현의 공간 및 시간적 패턴을 연구하는 데 유용합니다. 유전자 전사의 단백질 제품을 대상 항체가 아직 개발 및 / 또는 사용 가능한 항체를 사용하여 차별화된 수 없습니다 게놈에서 특정 단백질의 여러 유전자 사본이있다하지 않은 경우, 시터스 대신 사용할 수 있습니다. 애벌레 날개 디스크 현장 기술에 몇 년 동안 나비 커뮤니티에 제공하고있는 동안, 현재의 프로토콜은 더 큰 더 연약한 pupal 날개에 대한 최적화되었습니다.
프로토콜
1 일
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 10X PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- ddH 2 O
- 0.1 % 총 볼륨의 DEPC를 추가하고 적극적으로 해결책을 흔들.
- 압력솥.
- 4 % Paraformaldehyde 픽스 - PBS - DEPC를 사용하여
- Proteinase K 솔루션 - 침전물이 존재하는 경우, 소용돌이 적극적으로 나누어지는를 제거하기 전에
- 소화 스톱 버퍼
- Prehybridization 버퍼
- 50:50 PBT : Prehybridization 버퍼
- 하이브 리다이 제이션 버퍼
- 솔루션은 RNase 무료 보관해야합니다. 어느 구운되었습니다 유리 도자기 (250에서 4시간 ° C) 또는 일회용 플라스틱을 사용합니다. Serological pipettes 솔루션을 만들기위한 매우 유용합니다
- PBS에서 가장 날개를 해부하다 시간 연출 pupae
- 상온에서 24 자 문화 판의 우물에서 버퍼를 해결하려면 직접 날개 이동
- 2 시간 동안 디스크를 수정
- PBT 5 X 5 분 와시
- Proteinase K 용액에서 3 분간 날개를 품어
- 소화 스톱 버퍼 2 X를 린스
- PBT 5 X 5 분 와시
- 50:50 PBT 2 X 5 분 와시 : PHB
- PHB 1 X 10 분 와시
- 55 PHB 적어도 1 시간에 품어 ° C.
- 열 변성 RNA 프로브 (20 - 50ng 잘마다 필요한) (80 ° C 5 분)와 하이브리드화 버퍼 (100 μl 아니라 당 필요)에 추가
- 우물에 프로브를 추가하고 55에서 48 시간 품어 ° C
3 일
- 55 4 X 5 분 씻어 ° C PHB
- 55 PHB에 밤새 품어 ° C
DAY 4
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 항체 블럭 버퍼
- PHB : 50:50 PBT 1 X 5 분 와시
- PBT 4 X 5 분 와시
- 4 블럭 버퍼에서 1 시간 동안 품어 날개 ° C
- 4 박 안티 파 항체의 1:2000 희석에 날개를 품어 ° C
5 일
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 감지 버퍼
- 개발 솔루션 - 민감한 빛 (호일에 포장)
- 상온에서 PBT 3 X 5 분 와시
- PBT의 와시 7 X 오분
- 감지 버퍼에 날개를 두 번 씻어
- 솔루션 개발 1 ML에 날개를 개발 - 개발의 시간은 각각의 시간을 모니터링해야합니다 - 동일한 프로브 및 개발 솔루션을 사용하면 개발 시간도 변경하실 수 있습니다 - 일반적으로 하루에 간격을 증가 후 50~10분 후 확인합니다. 플레이트는 샘플을 검사하지 않을 경우 빛의 노출을 방지하기 위해 호일에 싸여 있어야합니다.
- 개발 중지 버퍼 다섯 번 린스
- 날개를 탑재합니다.
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토론
기존 프로토콜의 최적화
애벌레 날개 디스크에 현장 hybridizations 성공적으로 대의 coenia의 나비의 디스크를 사용하여 수행되었습니다 (캐롤 외 1994;. 키 외 1999;. 웨더비 외 1999가).. 현재 프로토콜은 애벌레 날개 stainings에 대한 캐롤 연구소에서 요청에 따라 사용할 수있는 세부적인 서면 프로토콜에서 맞게되었습니다. 우리가 만든 변경 사항은 애벌레와 pupal 날개 조직 간의 차이를 수용할 수 있도록 제공하고 있습니다. pupal hindwing 해부 동안 peripodial 멤브레인가 우물에 제거하고 포함되지해야합니다. 초기 수정 시간은 우리의 프로토콜에 더 이상하지만 이후 수정 단계가 제거되었습니다. 우리는 Proteinase K 솔루션의 10 배 희석은 여전히 성공적인 프로브 침투에 대한 허용하면서 깨지기 쉬운 pupal 날개 조직에 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 발견 날개를 차단 항체 얼룩이 크게 감소 배경을하기 전에 4 하룻밤에 항체 보육을 증가 반면 ° C 신호의 강도를 증가.
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감사의 글
우리는 제인 Selegue, 마가렛 홀링스워스, 진 베리, 료 Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, 알렉산더 Popadic, 밥 리드,이 프로토콜을 문제 해결에 대한 도움을 로체 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 동영상을 편집에 대한 조언 윌리엄 피엘 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 고정 완충액 | PBS 내 4% Paraformaldehyde | |||
| PBT | PBS 내 0.1% Tween 20 | |||
| Proteinase K 용액 | PBT 내 2.5mg/ml Proteinase K | |||
| 소화 정지 완충액 | PBT 내 2 mg/ml glycine | |||
| 전-하이브리다이제이션 완충액 | 50 ml PHB 제조 시: DEPC 처리된 물 12 ml + Formamide 25 ml + 20 x SSC 12.5 ml + Tween 20 50 ul + 10 mg/ml salmon sperm 500 ul (Rnase free, 용액에 첨가하기 전 열 변성 처리). | |||
| 하이브리다이제이션 완충액 | 전-하이브리다이제이션 완충액에 1 mg/ml glycogen 추가 | |||
| 블로킹 완충액 | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase 접합 |
| DIG 세척 및 블로킹 완충액 세트 | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | 봉입제 |
참고문헌
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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