더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

요약

이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함 원위치 하이브 리다이 제이션 절차.

초록

여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명

프로토콜

이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 ^1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션 세척을 제외하고, 상온에서 실시하는 것입니다. 이 방법에 관련된 모든 단계에 필요한 솔루션 및 버퍼는이 프로토콜의 끝 부분에서 찾을 수 있습니다.

1. 조직 준비 및 Sectioning

1. 참살 빠르게 주제의 두뇌를 추출하고, 적절한 크기의 플라스틱 금형에 넣습니다.
2. 조직 테크의 포함 매체와 두뇌를 커버하고 빠르게 빠른 냉동 dry-ice/alcohol 목욕탕에서 플라스틱 금형을 놓으십시오. 냉동 조직은 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다.
3. 그라 이오 스탯을 사용하여 청구 Superfrost 플러스 슬라이드에 슬라이드 당 2 ~ 3 두뇌 섹션을 수집합니다. 섹션의 두께는 10-12 μm의해야합니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. <....

토론

우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally - 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 ^8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수있을 것으로 예상했습니다. 신뢰할 수있는 결과와 최적의 신호를 취득하는 데 필요한 키 컨트롤의 그룹을 다른 ^{11, 12에} 의해 광범위하게 자세한되었습니다.

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재료

솔루션

1. 칼럼 세척 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 0.15 M NaCl, 0.05 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 50 μg / μl tRNA, 0.1 % SDS.
2. 열 차단 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 50 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
3. TNT 버퍼 : 60 ML 1 M 트리스 - HCL, 5 M NaCl 18 ML과 트리톤의 1.8 ML DEPC - 처리된 물 600 ML에서 X - 100.
4. TNB 버퍼 : 100 MM 트리스 - HCL, 8.3 μg / μl BSA, 0.15 M NaCl 3 % 트리톤 DEPC - 처리된 물에 X - 100.
5. TE 버퍼 : 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 플러스 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5.
6. 아세틸화 솔루션 : triethanolamine 플러스 DEPC - 처리된 물 200 ML에 아세트산 무수물 0.5 ML의 2.7 ML.
7. 하이브 리다이 제이션 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 2X SSPE, 2 μg / μl tRNA, 1 μg / μl BSA 및 1 μg / DEPC - 처리된 물에 μl 폴리. 이 섹션마다 16리터이 필요합니다.