좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
발달 생물학의 중심 주제는 lineages의 다변화 및 기본 분자 메커니즘의 해설입니다. 이것은 정상 및 실험 조건에서 단일 세포의 운명의 철저한 분석을 알아볼 수 있습니다. 이를 위해 하나의 progenitors를 대상으로 transfection 방법은 꼭 필요합니다. 우리는 여기에 유전자 조작뿐만 아니라 신뢰할 수있는 추적 혈통, - 비켜에서 닭 조직에서 단일 세포를 transfecting 수를위한 기술적 간단한 방법을 설명합니다. 특정 조직 도메인은 체절 또는 신경 튜브 내에 타겟으로하고 있으며, DNA가 단일 세포의 산발적 transfection 그 결과, 관심의 상피에 직접 주입합니다. 기자를 사용 clonal 인구는 따라서 3 일이에 추적될 수 있으며, 유전자 조작 clonal 인구의 동작은 컨트롤의와 비교할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 조작을위한 새로운 도구와 함께 여자는 배아의 접근을 활용합니다. 우리는 비교하고 널리 사용되는 electroporation 방법을 통해 장점과 가능한 응용 프로그램을 토론하고 또한 제안 추가에서 - 생체내 모델에 사용합니다. 우리는 기존의 혈통 추적 및 유전자 간섭 도구 상당한 또한 및 보완이 방법의 사용을 옹호.
프로토콜
1. Micropipettes의 준비
우리는 13.5의 열 설정을 표준 Narishige PP - 83 피펫 끌어당기는에 우리 pipettes를 가져옵니다. 정확한 설정은 8시 사이에 10 미크론의 피펫 팁의 직경을 목표로, 보정해야합니다. 우리는 필라멘트 함유 1.0 mm와 0.75-0.78 mm의 내경의 외부 직경 borosilicate 유리 튜브를 사용합니다. pipettes은 결과적으로 접시의 가장자리에 접촉으로부터 보호 도움말과 플라스틱 그릇에 저장됩니다.
2. DNA 준비
관심 플라스미드는 DH5α E.으로 transfected 있습니다 표준 절차를 사용하여 대장균. 하나의 식민지에서 숙박 문화는 플라스미드를 사용 맥시 - 준비 키트 (상업적 키트해야) 정화하는 데 사용됩니다. 우리는 1.0의 플라스미드 농도 비 clonal 주사에 대한 μg / μL를 사용합니다. 높은 농도는 피펫 팁의 막히는을 향상시킬 수 있습니다. clonal 어플 리케이션의 경우, 플라스미드 농도는 훨씬 낮은 있으며 (아래 참조) 조정해야합니다. pCAGG - GFP 들어, clonal 결과를 생산 최적의 농도는 약 0.05-0....
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토론
위에서 설명한 방법은 작은 세포 하위 집합 또는 단일 progenitors 3 lipophilic 염료를 전달하기위한 이전에 설명한 기법의 수정입니다. 이것은 표준 electroporation 기법을 통해 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, electroporation보다 훨씬 큰 공간 해상도 (C, 예를 들어 그림 1B에 대한 참조) 허용, 대상 조직에 대한 신뢰 개별 사이트로 라벨을위한 수단을 제공합니다. 둘째, 따라서 달리 정상적인 조건 1 2 (그림 1C, D)에 따라 - 생체내들의 혈통을 추적할 수 있도록, 단일 세포의 라벨링 수 있습니다. 셋째, 단일 세포 수준에서 유전자 미스 표현은 달리 정상을 배경으로 성장 요인이나 세포 행동에 다른 유전자의 역할을 공부에 대한 가계의 분리의 분자 메커니즘을 조사하기위한 도구를 제공, 등 그러므로,이 방법 보완 널리 적용 electroporation 기법, 그리고 더 이상은 spatio - temporally 규제 이득 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 신경 튜브 이미지 Shlomi Krispin 감사합니다. 특히, 우리는 GFP의 transfection 기술을 시작을위한 Yuval 계피를 인정합니다. 이 작품은 CK하는 이스라엘 과학 재단, 협회 테크 프랑세즈 contre 레 Myopathies하고, 도이치의 Forschungsgemeinshaft, 공동 연구 센터 488에서 보조금에 의해 지원되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피펫 튜브 | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| 모세관 | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| 곤충용 바늘 | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep 용액 | Biological Industries | 03-031-1B |
참고문헌
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C.
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재인쇄 및 허가
