이 프로토콜은 살아있는 쥐 두뇌의 특정 영역에 유전자 구성의 제공이 아닌 바이러스 방법을 설명합니다. 방법은 플라스미드 준비, micropipette 제조, 신생아 쥐 새끼 수술, 구조의 microinjection과로 구성되어 있습니다 생체내에 electroporation.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 변형 동물의 창조는 생체내에 대한 관심의 유전자의 기능을 연구의 표준 방법입니다. 그러나 대부분의 녹아웃이나 유전자 변형 동물은 수정 유전자가 표현하거나 전체 유기체에서 삭제됩니다 이러한 경우에는 가능한하지 않습니다. 또한, 보상 메커니즘의 다양한 종종 어려운 결과를 해석하는 있도록. 보상 효과는 어느 타이밍 유전자 발현이나 transfected 세포의 양을 제한하여 완화된 수 있습니다.
출생 후의 비 심실 microinjection 및 생체내의 electroporation의 방법은 직접 신생아 쥐 두뇌에 대한 관심의 작은 지역으로 유전자, siRNA 또는 염료 분자 타겟으로 배달을 허용합니다. 기존의 심실 사출 기술에 대조적으로,이 방법 이외의 철새 세포 유형의 transfection 수 있습니다. 방법 여기에서 설명한 방식으로 transfected 동물 생체내 이미징이나 급성 뇌 조각에 electrophysiological 실험에서 두 광자에 대한 예를 들어, 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 소개
유전자 변형 동물의 창조 동물 1 생활과 무너지고 질병 메커니즘 2,3뿐만 아니라 세포 4 속성을 조작을위한 유전자 기능 조사의 강력한 방법입니다. 그러나, 절차 따라서 이러한 바이러스 주사 5, electroporation 6과 utero electroporation 7,8에서 신생아 심실 주입과 같은 다른 유전자 전달 방법의 사용을 warranting, 매우 시간이 소요되고 비용이 상당히 힘드는입니다. ; 관심 지역의 지역 표현식 패턴을 만들 가능성, 비 철새 세포 유형의 현장 transfection에, 예를 들어 대뇌 피질 이외의 바이러스 유전자 구조의 사용 : 출생 후의 비 심실 주입과 electroporation의 방법은 장점의 고유 설정을 가지고 astrocytes.
이 비디오에서는, 우리는 CMV 확장기 (pCAG - EGFP) 9 닭고기 베타 굴지 프로 모터에서 향상된 녹색 형광 단백질에 대한 플라스미드 인코딩을 사용하여 신생아 쥐의 뇌에 출생 후의 유전자 전달의 세부 절차를 보여줍니....
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토론
생활 쥐 두뇌에 유전자 전달 방법은 잘 출생 후의 electroporation 6보다 최근 utero electroporation 7,8,11,12에 대한 설립하고 있습니다. 그러나 이러한 방법은 여러 어플 리케이션에 제한 수있는 플라스미드 DNA의 심실 주사를 기반으로합니다. 예를 들어, 이러한 방법은 해마, 대뇌 피질이나 astrocytes 같은 비 철새 세포 유형의 transfection와 같은 특정 뇌 영역에서 세포를 대상으로 허용하지 않습니다. electroporation과 함께 비 심실 분사 먼저 소뇌 뉴런 13로 유전자 전달을 위해 사용되었다. 우리 프로토콜은 쥐 두뇌의 다른 지역에 비 심실 방법의 확장을 보여줍니다. 우리는 우리의 방법 론적 접근 방식이 출생 후의 쥐 뇌에 5 이내에 관심이 제한된 지역에 유전자 전달의 바이러스 방법에 유용한 대안이라고 제안합니다.
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감사의 글
우리는 비디오 사운드 트랙 녹음, 전투 편대 - EGFP 플라스미드 준비 3D 애니메이션 박사 피터 Blaesse에 대한 이반 Molotkov와 관련하여 도움이 예카 Karelina 감사합니다.
작품은 핀란드의 국제 이동성, 핀란드어 문화 재단과 핀란드의 아카데미의 센터에서 부여에 의해 지원되었다.
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재료
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| 스테인리스강 가열 패드가 포함된 생물학적 온도 조절기 | 장비 | Supertech | TMP-5b | |
| 필라멘트가 포함된 붕규산 유리관 | 재료 | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | 유리 니들 |
| 일회용 드릴 | 재료 | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | 시약 | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 포셉, 110 mm | 장비 | Fine Science Tools | 91150-20 | 수술 조작 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리 |
| Ealing 마이크로–전극 풀러 | 장비 | Ealing | 50-2013 | 수직 전극 유리 풀러 |
| Ethilon 단사 폴리아미드 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | 재료 | Johnson & Johnson | EH7177H | 수술용 실 |
| Exmire 마이크로 시린지 10.0 ml | 장비 | Exmire | MS*GLLX00 | 가스 타이트 시린지 |
| Fast Green | 시약 | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| 포셉 전극 | 장비 | BEX | LF650P3 | 사용 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리 |
| Foredom 드릴 컨트롤러 | 장비 | Foredom | FM3545 | 수술용 드릴 전원 공급 장치 및 컨트롤러. 현재 이용 가능한 유사 제품은 마이크로모터 키트 K.1070 (Foredom)임 |
| Foredom 마이크로 모터 핸드피스 | 장비 | Foredom | MH-145 | 현재 이용 가능한 유사 제품은 마이크로모터 키트 K.1070 (Foredom)임 |
| 마우스용 가스 마취 플랫폼 | 장비 | Stoelting Co. | 50264 | 정위 고정 장치에 조립됨 |
| Isoflurane | 시약 | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
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참고문헌
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2
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