spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.
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방법 논문
Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서
이 논문에서
요약
초록
정보가 모두 혜택을 산업용 애플 리케이션뿐만 아니라 기본적인 근본적인 생물 학적 지식을 향상을 축적하기 때문에 살아있는 세포의 단백질 상호 작용의 연구는 연구의 중요한 영역입니다. 전자 흥분 상태에서 기증자의 분자와 가까운 수용체 분자 사이의 포스터 (형광) 공명 에너지 전송은 (무서워) 자주 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 위해 이용되었다. 관심의 단백질은 형광 프로브의 두 가지 종류의 태그 및 생물 학적 세포에 표현됩니다. 형광 프로브는 다음 일반적으로 레이저 빛을 이용하여, 흥분되며, 형광 프로브에서 냄새가 나는데 형광 방출의 스펙트럼 특성을 수집 및 분석이다. 단백질 상호 작용의 정도에 관한 정보는 스펙트럼 방출 데이터에 포함됩니다. 일반적으로, 세포가 정확하게 세포 내에서 관심을 각 지역의 단백질 상호 작용의 범위를 정할 충분한 스펙트럼 정보를 축적하기 위해 여러 번 스캔해야합니다. 그러나 이러한 영역의 분자 구성은 전체 세포 이상의 평균 명백한 걱정 효율성의 정량 값의 공간적 결정을 제한, 인수 과정의 과정에서 변경될 수 있습니다. spectrally 해결 두 광자 현미경을 통해, 우리는 관심의 샘플 단 하나의 완전한 여기 스캔 후 spectrally 해결 이미지의 전체 집합을 얻을 수 있습니다. 이 픽셀 수준의 스펙트럼 데이터의지도 세포 전반에 걸쳐 효율성이 계산됩니다 무서워. 의 실험적 얻은 배포 oligomeric 단지에 걱정의 간단한 이론을 적용하여 세포 전반에 걸쳐 효율성이 무서워, 하나의 spectrally 해결 검사 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 및 구조 정보를 보여줍니다. 여기 형광 프로브의 두 가지 종류의 태그가 막 수용체 (멸균이 α - 계수 수용체)을 표현하는 생물 학적 세포 (효모 Saccharomyces cerevisiae) 준비 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 사용하여 형광 데이터를 수집에 관련된 중요한 요소를 설명합니다. 이 프로토콜의 사용은 그것에 붙어 형광 마커로 살아있는 세포에 표현할 수 단백질의 모든 종류의 연구를 확장할 수 있습니다.
프로토콜
1. 플라스미드 디자인
관심의 단백질은 다음 설명한 바와 같이, 두 가지 형광 레이블 중 하나에 융합하고 있습니다. 형광 라벨은 단백질 1의 게이 oligomerization에 관한 세포 내에서 단백질의 위치뿐만 아니라, 양적 정보에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 형광 공명 에너지 전달 (무서워) 2-4 기술은 50-10 단백질 상호 작용에 대한 정보를 축적하는 데 사용됩니다. 안달는 에너지의 전송이 unexcited 분자 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용이 11를 통해 (일반적으로 수용체, A라고도 함)에 광학 흥분 분자 (일반적으로 기증자, D라고도 함)에서 발생할 수있는 원리를 이용하는 경우 두 분자 서로 가까이 와서. 융합 단백질을 인코딩 plasmids를 디자인에서 두 가지 핵심 기능이 마음에 부담되어야, 다음과 같은.
- 형광 태그 호환 쌍의를 선택하면 공부를 걱정에 최고 중요성이다. 기증자 태그의 방출 스펙트럼과 수용체 태그의 여기 스펙트럼과 레이저 펄스 스펙트럼의 중심 파장 및 여기 스펙트럼 사이에 큰 분리 사이의 파장에서 감지할 수있을 정도의 중복 : 이상적으로, 형광등 태그 조합은 두 기준을 충족해야합니다 수용체의 (즉, 대형 스톡....
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토론
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 생체내에 단백질 올리고머 복합에 대한 크기와 구조 정보를 확인하는 방법을 설명 하였다. 표시 데이터가 효모 세포에 표현 특정 막 수용체 (예 : Ste2p)에서 얻은 반면, 방법은 그것이 세포의 종류,하는 유일한 규정에 표현 단백질의 어떤 유형에 적용할 수있는 모든 포괄되는 단백질 적절한 형광 마커가 추가됩니다. 이 프로토콜에 향후 수정 시간 의존 단백질 올리고머의 크기와 구조 변경을 모니터하기 위해 높은 스캔 속도를 달성하기 위해 악기를 향상 포함됩니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 UW - 밀워키 연구 성장 이니셔티브, 바이오 메디컬 및 건강 기술에 대한 위스콘신 연구소, 그리고 브래들리 재단에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 펩톤(Peptone) | Fisher Scientific | BP1420 | |
| 효모 추출물(Yeast Extract) | Fisher Scientific | BP1422 | |
| 폴리에틸렌 글리콜(Polyethlyene Glycol) 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| (NH4)2SO4 및 아미노산 제외 효모 질소 기질(Yeast Nitrogen Base) | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| 효모 합성 드롭아웃 배지 보충제(Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-글루코스(D-Glucose) | Fisher Scientific | D16-1 | |
| 한천(Agar) | Fisher Scientific | S70210 | |
| 황산암모늄(Ammonium Sulfate) | Fisher Scientific | A702-500 | |
| 염화칼륨(Potassium Chloride) | Acros Organics | 424090010 | |
| 류신(Leucine) | Fisher Scientific | BP385 | |
| 히스티딘(Histidine) | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x 오일 침수 대물렌즈 NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| 분광 분해 이광자 현미경(Spectrally resolved two photon microscope) |
참고문헌
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A.
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재인쇄 및 허가
