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방법 논문

항원 특정 VIVO에서 죽이는 분석

19.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/2250

⸱

2010년 11월 9일

 ,  , 
1Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2Pathobiological Sciences, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지 않습니다 1. CTL 품질 측정 중 하나는 특별히 죽이는 능력이있다 2. 대상 세포의 CFSE 라벨이 CTL 응답 품질을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 생체내에 3,4.

초록

Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 쉽고 빠르게 생체내 수사에 대한 관심의 세포 인구를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 라벨은 고전적인 증식 및 마이 그 레이션을 공부하기 위해 사용되었습니다. 여기서 제시하는 방법, 우리는 에피토프 특정 CFSE 표시 대상 세포 4-6의 생존과 살인 볼 입양 전송 후 일정을 단축했습니다. 그들의 수량이 오해 할 수 있으므로 CD8 + T 세포 클론의 특정 살인의 수준은 응답의 품질을 나타낼 수 있습니다. CD8 + T 특정 세포가 시토킨 생산 및 살인 7,8의 감소와 함께 시간이 지남에 따라 기능 소진 될 수 있습니다. 또한, 특정 CD8 + T 세포 클론은 TCR의 specificities 9 각기 다른뿐만 아니라 다른 사람으로 죽일 수 없습니다. 효과적인 세포 매개 내성 (CMI)의 경우, 항원은 T 세포 응답의 충분한 숫자뿐만 아니라 생산 파악뿐만 아니라, 강력한 기능 responding T 세포를해야합니다. 여기 BALB / C 마우스의 두 펩타이드 구체적인 T 세포 클론의 비율 세포 구체적인 살인을 평가합니다.

프로토콜

1. 예방 접종의 대상 - 특정 효과기 CTLs을 도출하는 것은 (주 0)

  1. 대상 시스템 : 시작하기 전에, 특정 이펙터에 따라 결정합니다. 생체내 CTL 분석의 고전이 예제에서, 우리는 특정한 CD8 + T 세포를 이끌어내는 수있는 정화 펩타이드 예방 접종을 사용합니다. 대상 시스템 : 동일한 펩타이드는 특정 이펙터를 작성, syngeneic 대상 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 또는 특정 effectors와 목표를 얻기 위해 전체 병원균이나 단백질을 사용하도록 선택할 수 있습니다.
  2. 주사의 불임을 보장하기 위해 biosafety 후드의 작업 표면 안으로 오염을 제거하다. 먼저 두 ML 튜브에 포함된 PBS / 마우스 100 μL의 10 % DMSO에 펩타이드를 정화 50 μg을 배치하여 펩타이드 예방 접종을 준비합니다. 다음 혼합을 위해 1mm 구슬로 최대 0.2 ML 마크 매우 추운 불완전 프로 인드의 도움이되는의 동일한 금액을 추가합니다. 이 시점에서 사출까지 얼음에 immunogen 보관하십시오. Parafilm과 보안 덮개.
  3. 즉시 혼합 후 얼음 다시 감광 유제를 삽입, 3 분 동안 감광 유제를 섞어 최대 RPM을 설정 구슬 때리는을 사용합니다. 결과 유제 일관성에 마요네즈와 유사해야합니다. 유제 4에 앉아 ° C 밤새 어떤 분리가 명시된 경우에는 시간이 허용하는가 (최대 주), 더 혼합하는 경우. 허용
  4. 모든 구슬을 끌어하지 않도록주의하고 유제를 잡아 1 ML의 주사기와 20 게이지 바늘 20.5을 사용하여 (구슬이 바늘의 측정보다 클 수 있지만, 여전히 인식해야합니다.)
  5. 꼬리의 기지에 피하 주입을위한 보안 마우스. 우리는 안전에 대한 수정 플라스틱 50 ML 원뿔 관을 사용하여 부드럽게 주사 마우스를 고정. 유제의 0.2 ML로 마우스를 주사.

2. 수확 대상 셀 (주 8)

  1. 당신은 목표 세포에 대한 순진한 syngeneic 마우스가 필요합니다. AAALAC 기준에 따라 순진한 쥐를 안락사.
  2. 마우스 머리 또는 기타 외부 오염 물질로부터 오염의 가능성을 최소화하기 위해 70 % 에탄올을 분사하여 마우스를 소독.
  3. 해부 가위를 사용하면 마우스의 왼쪽에있는 피부를 통해 작은 싹둑합니다. 복막 색과 내장을 밝히기 위해서 피부 플랩을 세워.
  4. 복막을 통해 싹둑, 조심되는 근본적인 기관 중 하나를 타협하지 않습니다. 비장은 표면에 가까이 있으며 컬러 간 (어두운 빨강)과 비슷하지만 작고 모양이 더 신장 콩입니다. 감염된 마우스는 일반적으로 감염되지 않은 컨트롤보다 특히 큰 spleens을 보여줍니다.
  5. 조심스럽게있는만큼 최대 휴대폰 번호를 복구하기 위해서는 여러 조각으로 비장을 깰하지 부드럽게하는 간병, 비장을 당겨. 즉시 얼음 준비 매체 10 MLS를 포함한 15 ML 원뿔로 비장을 놓으십시오. 나머지 생쥐를 계속합니다.
  6. 유리 조직 분쇄기로 15 ML 원뿔 튜브 (미디어 및 비장)의 내용을 하거라. 팔 위쪽 강도 많이 사용하여 비장을 분쇄. 모든 조직은 그것의 색깔을 잃었되면 당신은 결합 조직 밖으로 모든 세포를 회수했다고 가정 수 있습니다.
  7. 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 필터를 통해 분쇄기의 내용을 하거라. 신선한 매체와 그라인더를 씻어 셀 스트레이너를 통해 부어.
  8. 4 원심 분리기 ° C, 7 분 동안 1,300 RPM. 뜨는을 하거라.
  9. 7분을 위해 37 °에서 준비 lysing 시약 및 부화 10 MLS에 Resuspend.
  10. 신선한 미디어와 원심 분리기, 상기와 같은과 50 MLS 개까지 추가할 수 있습니다.
  11. 50 MLS 신선한 미디어 및 원심 분리기 (세척 단계) 위와 같은에서 Resuspend. * 참고 : 순수한 대상 셀 인구가받는 마우스로 전송 원하는 경우이 시점에서 당신은 특정 세포 유형에 대한 자기 세포 분리 (예 : macrophages)를 수행할 수 있습니다. 또한이 시간에 당신은 특정 세포 죽이는 그 치료의 영향을 연구하기 위해 문화에 실험적 치료를 소개 수 있습니다.
  12. 96 잘 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100μL의 X 10 7 잘 따라 세포 및 플레이트 1 카운트. *이 세포 / 음의 높은 농도이지만, 분석이 간단하기 때문에, 우리가이 농도에서 세포의 생존에 손실을 본 적이있다.

3. 대상 세포 치료 및 라벨링

  1. 펄스 적절한 세포와​​ 병원체 특정 펩타이드 또는 펩타이드없는 컨트롤과 함께 복제 : 1 μg / ML 펩타이드를 추가합니다. 1.5 시간 4 ° C에서 알을 품다. 지난 30 분 동안 37 ° C 배양기로 이동합니다. 이 시간 동안 CFSE 시약을 준비합니다.
  2. 제조 업체 사양에 따라 CFSE을 준비하고 0.5 및 25 μm의 사이에서 작동하는 농도로 희석. "높음"농도 CFSE보다 낮은 '낮음'농도가 10X합니다. 예를 들어, [낮은] 10 MLS PBS에 0.​​5 μL CFSE를 추가하고 위해 [고급] 10 MLS PBS로 5 μL CFSE를 추가합니다. 37 따뜻한 준비 CFSE ° C 레이블링하기 전에.
  3. 인큐베이터와 P에서 세포의 플레이트를 제거합니다실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 고속 원심 분리기에 ellet. 뜨는 제거 플릭.
  4. [낮은] 또는 해당 우물 적절한 시약 200 μL를 추가하고 37 15 분 동안 품어 °에서 [고급] CFSE C. 어느 Resuspend 세포
  5. 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육하고 다시 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭.
  6. 37 200 μL / 잘 예열 신선한 매체와 30 분 동안 품어의 Resuspend 세포 ° C.
  7. 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육 및 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭.
  8. 100 μL / 잘 PBS에 Resuspend 세포.
  9. 입양 전송을위한 하나 추가 물론 [낮은] 한 레이블 셀 잘 [고등] 마우스 세포마다 표시. 주사를 발생하는 0.2 MLS에 50% 구체적인 목표 50 % 관련이없는 세포가되어야합니다.
  10. (그림 1 참조) 데이터 분석 도중 흐름 cytometer에서 실행에 대한 비 - 전송 제어의 역할을 몇 가지로 분류 세포를 별도로 설정하는 것을 잊지 마십시오.

4. 입양 전송

  1. AAALAC 기준에 따라 이전 펩타이드 예방 접종을 쥐 (이 프로토콜의 일부로 # 1에서) 마취.
  2. 받는 마우스로 역 궤도 경로를 통해 표시 대상 세포의 0.2 MLS를 주사.
  3. 받는 사람 쥐를 euthanizing 6 시간 전의 또는 기타 미리 결정된 최적의 시간을 기다리십시오.

5. 수확 라벨 셀

* 참고 : 5.11 통해 5.1 2.11 통해 2.1 단계와 동일합니다 단계

  1. 96 자 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100 μL의 X 10 6 자 당 1 셀 및 플레이트 아웃 카운트.
  2. 모든 우물을 1 % paraformaldehyde의 최종 농도 100 μL 2 % paraformaldehyde를 추가하여 회수 및 비 전송 세포를 수정.

6. 유동세포계측법 및 데이터 분석

  1. 흐름 cytometer에 샘플을 실행하고 데이터를 분석할 수 있습니다.

7. 대표 결과

결과 히스토그램에 떨어지 에피토프 특정 피크가 특정 세포 죽이는 (그림 1)의 지표이다. 특정 세포 용해의 실제 가치를 결정하기 위해 다음과 같은 방정식을 (표 1 적용)를 사용 :
비율 = 관련성이 비율 : 에피토프 특정 비율 ([낮은] 최대 : [고등] 피크),
퍼센트 특정 용해 = [1 - (비 전송 제어 비율 / 실험 비율)] X 100

그림 1
그림 1. BALB / C 마우스 splenocytes를 발견 했어요. 숫자 CFSE 프로필은 높거나 낮은 CFSE의 표현형의 세포의 비율을 나타냅니다. A) 컨트롤을 비 - 양도. [낮은] CFSE의 봉우리가없는 펩타이드와 펄스 목표를 대표하는 동안 모든 [고급] CFSE의 봉우리는 에피토프 특정 타겟 세포를 나타냅니다. B) CFSE 라벨이 세포는 PBS 예방 접종을받는 마우스 (컨트롤)에서 복구. C) 두 개의 다른 펩타이드 특정받는 마우스에서 발견한 CFSE 라벨 세포는 감소 에피토프 특정 봉우리를 적어 둡니다.

그림 2
그림 2. 분석 데이터의 그래픽 표현. 쓰리 데이터 요소는 마우스의 각 그룹, PBS, 펩타이드 및 펩타이드 B.에 대한 표시

견본 CFSE HIGH %의 에피토프는 펄스 엉뚱 CFSE LOW % 비율 낮음 : 높음 퍼센트 에피토프 특정 죽이는
PBS 42.8 57.2 1.34 16.97
PBS 43.1 56.9 1.32 15.94
PBS 44.3 55.7 1.26 11.74
펩타이드 39.7 60.3 1.52 32.56
펩타이드 38.6 61.4 1.59 35.61
펩타이드 40.6 59.4 1.46 29.99
펩타이드 B 38.7 61.3 1.58 24.68
펩타이드 B 38.5 61.5 1.60 25.32
펩타이드 B 39.3 60.7 1.54 22.76
PBS NT 제어 47.4 52.6
응원 NT 제어 49.4 50.6 1.02
펩 B NT 제어 45.6 54.4 1.19
1.11

표 1. 대표 데이터의 분석. "NT"는 아닌 전송됩니다.

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토론

CFSE가 자손 10,11 가운데 상대적으로 균등하게 분할하기 때문에 분석은 clonal 확장을 포함한 세포의 proliferative 용량을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 예제 tetramers 또한 CFSE 라벨과 함께있을 수 있습니다 bioluminescence 13, 귀하의 가정에 따라 더 적절한 수 방법을 추적 기타 조직이있다하지만, 휴대 마이 그 레이션 6,12를 조사하기 위해 CFSE 라벨을 사용하는 것도 가능합니다.

PE뿐 아니라 작동하지 않을 수 있습니다 동안 표면 마커에 대한 공동 얼룩 싶으면 너무, 흐름 cytometer에 여러 채널로를 통해 해당 CFSE의 스며들에 유의하는 것이 중요합니다, PeCy7는 형광단의 좋은 선택이 될 것입니다.

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 동물 실험은 위스콘신 - 매디슨 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

감사의 글

나는 면역 assays 및 마우스 처리 나를 소개하는 비앙카 Mothé, 칼라 Oseroff 및 마리 - 프랑스 DelGuercio 감사하고 싶습니다. GA 분배기의 연구실에서 작업이 NIH 그랜트 1 RO1 - AI - 073558, GLRCE 부여 1 - U54 - AI - 057153 및 바드 미국 3829-06에 의해 후원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mm 유리 비즈Biospec Products11079110
70 μm 세포 스트레이너BD Biosciences352350
96-웰 플레이트Costar3799
Adjulite 불완전 프로인트’s 보조제Pacific Immunologyn/a
DMSOSigma-AldrichD-5879
FBSGIBCO, by Life Technologies16000-077
FC 500 유세포 분석기Beckman Coulter Inc.n/a
Kontes 유리 조직 분쇄기Kontes Corp885300-0015
Mini BeadbeaterBiospec Productsn/a
바늘BD Biosciences305175
Parafilm "M"Pechiney Plastic PackagingPM992
파라포름알데히드Electron Microscopy Sciences157-8
PBSGIBCO, by Life Technologies10010-023
PharmLyse 용해 시약BD Biosciences555899
RPMI 1640GIBCO, by Life Technologies11875-093
주사기BD Biosciences309602
Vybrant CFSE 키트InvitrogenV12883

참고문헌

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
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