대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지 않습니다 1. CTL 품질 측정 중 하나는 특별히 죽이는 능력이있다 2. 대상 세포의 CFSE 라벨이 CTL 응답 품질을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 생체내에 3,4.
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이 논문에서
요약
초록
Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 쉽고 빠르게 생체내 수사에 대한 관심의 세포 인구를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 라벨은 고전적인 증식 및 마이 그 레이션을 공부하기 위해 사용되었습니다. 여기서 제시하는 방법, 우리는 에피토프 특정 CFSE 표시 대상 세포 4-6의 생존과 살인 볼 입양 전송 후 일정을 단축했습니다. 그들의 수량이 오해 할 수 있으므로 CD8 + T 세포 클론의 특정 살인의 수준은 응답의 품질을 나타낼 수 있습니다. CD8 + T 특정 세포가 시토킨 생산 및 살인 7,8의 감소와 함께 시간이 지남에 따라 기능 소진 될 수 있습니다. 또한, 특정 CD8 + T 세포 클론은 TCR의 specificities 9 각기 다른뿐만 아니라 다른 사람으로 죽일 수 없습니다. 효과적인 세포 매개 내성 (CMI)의 경우, 항원은 T 세포 응답의 충분한 숫자뿐만 아니라 생산 파악뿐만 아니라, 강력한 기능 responding T 세포를해야합니다. 여기 BALB / C 마우스의 두 펩타이드 구체적인 T 세포 클론의 비율 세포 구체적인 살인을 평가합니다.
프로토콜
1. 예방 접종의 대상 - 특정 효과기 CTLs을 도출하는 것은 (주 0)
- 대상 시스템 : 시작하기 전에, 특정 이펙터에 따라 결정합니다. 생체내 CTL 분석의 고전이 예제에서, 우리는 특정한 CD8 + T 세포를 이끌어내는 수있는 정화 펩타이드 예방 접종을 사용합니다. 대상 시스템 : 동일한 펩타이드는 특정 이펙터를 작성, syngeneic 대상 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 또는 특정 effectors와 목표를 얻기 위해 전체 병원균이나 단백질을 사용하도록 선택할 수 있습니다.
- 주사의 불임을 보장하기 위해 biosafety 후드의 작업 표면 안으로 오염을 제거하다. 먼저 두 ML 튜브에 포함된 PBS / 마우스 100 μL의 10 % DMSO에 펩타이드를 정화 50 μg을 배치하여 펩타이드 예방 접종을 준비합니다. 다음 혼합을 위해 1mm 구슬로 최대 0.2 ML 마크 매우 추운 불완전 프로 인드의 도움이되는의 동일한 금액을 추가합니다. 이 시점에서 사출까지 얼음에 immunogen 보관하십시오. Parafilm과 보안 덮개.
- 즉시 혼합 후 얼음 다시 감광 유제를 삽입, 3 분 동안 감광 유제를 섞어 최대 RPM을 설정 구슬 때리는을 사용합니다. 결과 유제 일관성에 마요네즈와 유사해야합니다. 유제 ....
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토론
CFSE가 자손 10,11 가운데 상대적으로 균등하게 분할하기 때문에 분석은 clonal 확장을 포함한 세포의 proliferative 용량을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 예제 tetramers 또한 CFSE 라벨과 함께있을 수 있습니다 bioluminescence 13, 귀하의 가정에 따라 더 적절한 수 방법을 추적 기타 조직이있다하지만, 휴대 마이 그 레이션 6,12를 조사하기 위해 CFSE 라벨을 사용하는 것도 가능합니다.
PE뿐 아니라 작동하지 않을 수 있습니다 동안 표면 마커에 대한 공동 얼룩 싶으면 너무, 흐름 cytometer에 여러 채널로를 통해 해당 CFSE의 스며들에 유의하는 것이 중요합니다, PeCy7는 형광단의 좋은 선택이 될 것입니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 동물 실험은 위스콘신 - 매디슨 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
나는 면역 assays 및 마우스 처리 나를 소개하는 비앙카 Mothé, 칼라 Oseroff 및 마리 - 프랑스 DelGuercio 감사하고 싶습니다. GA 분배기의 연구실에서 작업이 NIH 그랜트 1 RO1 - AI - 073558, GLRCE 부여 1 - U54 - AI - 057153 및 바드 미국 3829-06에 의해 후원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mm 유리 비즈 | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm 세포 스트레이너 | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-웰 플레이트 | Costar | 3799 | |
| Adjulite 불완전 프로인트’s 보조제 | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 유세포 분석기 | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes 유리 조직 분쇄기 | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| 바늘 | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| 파라포름알데히드 | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse 용해 시약 | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| 주사기 | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE 키트 | Invitrogen | V12883 |
참고문헌
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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재인쇄 및 허가
