방법 논문

콜론은 (CASP) 복막염 스텐트 Ascendens - Polymicrobial 복부 패혈증에 대한 표준 모델

DOI:

10.3791/2299

⸱

2010년 12월 18일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Greifswald

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

콜론은 (CASP) 복막염 스텐트은 설치류에 polymicrobial 복부 패혈증에 대한 높은 표준 모델입니다 Ascendens. 이 문서는 CASP의 수술에 대해 설명합니다. CASP 모델 및 그 변종은 패혈증의 주제에 관한 다양한 문제의 체계적인 조사를 허용합니다.

초록

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패혈증 전세계 집중 치료 단위에서 지속적인 문제가 남아있다. 패혈증의 복잡한 메커니즘을 이해하는 것은이 분야에 새로운 치료 방법을 확립을위한 조건입니다. 따라서, 동물 모델은 밀접하게 인간의 질병을 모방하며 충분한 과학적 질문을 다룰 수있다는 점을이 필요합니다. 콜론은 (CASP) 복막염 스텐트은 설치류에 polymicrobial 복부 패혈증에 대한 높은 표준 모델입니다 Ascendens. 이 모델에서, 작은 스텐 트가 수술 복막 구멍으로 창자 박테리아의 지속적인 유출로 이어지는 마우스 또는 쥐의 상승 결장에 삽입됩니다. 절차 복막염, 체계 bacteraemia, 굿 세균에 의해 장기 감염, 그리고 여러 프로 및 안티 - 염증성 크린 시토킨의 체계뿐만 아니라 지역 릴리스에 발생합니다. CASP의 파괴 장면을 보여 주죠가 삽입된 스텐 트의 직경에 의해 제어할 수 있습니다. 이 모델의 변종, 개입 (CASPI)과 함께 소위 CASP은 임상 연습에있는 일반적인 절차에 따라 두 번째 작업으로 발효 포커스를 제거하는 기회를시킵니다. CASP는 밀접​​하게 복부 패혈증의 임상 과정을 모방 쉽게 learnable과 높은 재현성 모델입니다. 그것은 여러 과학 분야 예 : 면역학, infectiology, 또는 수술의 질문에 대한 공부 방법을 주도하고 있습니다.

프로토콜

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1. 마우스를 준비

  1. 마약 유체의 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취 (시약의 표 참조)하고 나태한 위치에 놓으십시오.
  2. 마우스의 발이 작업하는 동안 동물의 안정적인 지위를 보장하기 위해 접시에 테이프로 고정해야합니다.

2. 조작

  1. 일반적으로 인간 IV 주사에 사용되는 IV 정맥을 타고와 팁로부터 플라스틱 튜브 circularly 2mm를 개척. 우리는 사망률 속도 (; 16GA (1,7 x45mm, 180 ML / 분) 14GA (2,0 x45mm, 270 ML / 분) BD Venflon 18GA를 (1,2 x45mm, 80 ML / 분)) 제어 cannulas의 세 가지 다른 크기를 사용합니다.
  2. 복부 피부의 철저한 소독 후, 15mm에 대한 자사의 정중선을 따라 그것을 절개. linea 알바 따라 복부 근육과 복막을 절개하여 복막 동굴을 엽니다.
  3. cecal 장대를 확인하고 신중하게이게 맹장, 터미널 회장과 면화 면봉을 사용하여 복부 밖으로 오름차순 콜론을 빼낸다.
  4. 15mm는 ileocecal 벨브에서 말초 하나는 은빛 7 / 0 봉합으로 오름차순 결장의 벽에있다. 따라서, 굿 혈관의 병변은 피할 수있다. 봉합사는 두 수술 노트로 colonic 벽면에 고정됩니다.
  5. 지금 찔린 7 / 0 봉합에서 근위 준비 정맥 1~2밀리미터와 오름차순 콜론. 플라스틱 튜브에 주름살이 serosa있는 수준까지 조심스럽게 콜론에 정맥를 삽입합니다.
  6. 정맥 주위 7 / 0 봉합의 자유로운 끝을 넣고 정확히 플라스틱 튜브의 준비 고랑에 두 배 매듭을 놓으십시오.
  7. 자, 콜론의 antimesenteric 벽을 통해 7 / 0 봉합사와 바늘 그것의 바늘을. 연속적으로 두 수술 옹​​이 또한 colonic 벽에 플라스틱 튜브를 해결하기 위해 수행해야합니다. 봉합사의 끝을 잘라.
  8. 정맥 약간의​​ 철분 부분을 검색하고 고정 7 / 0 봉합에 플라스틱 튜브를 가까이에서 (1mm)를 잘라.
  9. 이제 하나가 의자에 작은 팁이 스텐트 상단에 나타날 때까지 조심스럽게 면화 면봉을 사용하여 결장 스텐트 향해이게 맹장에서 대변을 우유에있다.
  10. 생리 식염수 0.5 ML의 intraperitoneal 행정부가 복막 동굴과 performe 유체 인공 호흡으로 다시 용기를 넣어.
  11. 연속 봉합 (4 / 0)와 복막을 닫습니다.
  12. 단수 봉합 (4 / 0)으로 피부를 닫습니다.

3. 수술후 관리

  1. 충분한 음식과 물을 포함되어야 그 새장에 동물을 다시 갖다 놔라. 진통제 들어, 강력한 진통 물질 (우리가 buprenorphine를 사용)의 intraperitoneal 관리는 정기적으로 실시하여야한다.
  2. 수술 후 처음 두 일 이내에, 하나는 동물마다 6 시간 제어할 수 있습니다.

4. 섐 CASP

  1. 1.1-2.4 단계를 수행합니다.
  2. 소중히 콜론을하지 마십시오. 그냥 단계를 2.6-2.8를 수행합니다.
  3. 2.10-3.2 단계를 수행합니다.

5. CASPI

  1. 14G 정맥의 다음 단계 1.1-3.1를 사용 CASP 수행
  2. 5h는 CASP 한, 다시 동물을 운영하고 있습니다. 1.1-1.2 단계에 따라 다시 마우스를 준비하고 마취
  3. 복벽의 봉합을 엽니다.
  4. 삽입한 스텐 트와 함께 상승 콜론을 당겨.
  5. 조심스럽게 스텐트을 고정 봉합을 잘라 스텐 트를 제거합니다.
  6. 하나의 반전 봉합 (7 / 0)와 콜론의 결함을 닫습니다.
  7. 복강에 다시 용기를 넣고 생리 식염수 10 ML과 함께 두 번 후자를 플러시.
  8. 연속 봉합 (4 / 0)와 복막을 닫습니다.
  9. 단수 봉합 (4 / 0)으로 피부를 닫습니다.
  10. 3.1-3.2 단계를 따르십시오

6. 대표 결과

작업 다음과 같은 몇 시간 내에 동물은 시작의 패혈증의 임상 증상을 보여줍니다. 질병의 전형적인 증상은 발한, 이동성, 곤두선 코트를 감소, 음식 섭취, 체중의 손실 또한 감소 도주 행동을 감소. 연속 전신 감염 심각한 복막염을 개발 동물은 일반적으로 48h 이내에 죽어. 삽입된 스텐 트의 크기에 따라 별개의 사망률 요금을 생성할 수 있습니다. 100 % 사망률에 14G 스텐트 결과 16G 70 %의 사망률을 제공하고, 50 % 사망률 가격은 18G 스텐트 (그림 1A)를 사용하여 도달할 수 있습니다. 100 % 생존율의 섐 운영 결과. 보통, 모든 동물은 CASP 후 첫 48 시간 inbetween 죽어라. 따라서,이 시점에서 살아있는 모든 동물은 생존으로 간주 될 수 있습니다. 그러나, 우리는 희귀 "늦은 사망"CASP 이후를 검색하는 최소한 72 시간 추가 관찰 기간을 권장합니다.

CASPI의 결과는 스텐트 제거 CASP 후 시간의 기간에 따라 달라집니다. 개입 3H 45%의 생존율에 CASP 결과 후. 스텐트는 CASP의 10 % 이후 5h 제거하는 경우동물 절차를 생존. 100 % (그림 1B)의 사망률에 9h 결과 후 스텐트 제거. 섐 CASPI 100 % 생존 발생합니다. 일반적으로 나중에 CASP 후 48 시간 이상 죽는 동물이 있기 때문에 CASPI 설정을 위해, 우리는 10 일 관찰 기간을 권장합니다.

부종, vasodilatation, erythematic 굿 벽, Peyer의 패치의 날카로운 경계, 굿 마비, 무료 유체 및 발효 분비 (그림 2) : CASP 후 복부 시터스 24 시간 매크로 검사는 복막염의 전형적인 징후를 보여줍니다.

전신 감염이 세균 분석으로 표시된 수 있습니다. 12시간 CASP 후, 엄청난 양의 세균이 복막 세척에서 검색된 수있다, 혈액, 간, 폐, 비장, 신장. 박테리아의 질적 분석 E.와 같은 전형적인 굿 세균에 의해 감염을 체계적 공개 대장균, bacteroides 종, enterococcus 종 등 (그림 3).

CASP 유도된 패혈증 프로 및 안티 - 염증 크린 시토킨 및 chemokines 지역 또한 체계적 릴리스에 승객 명단. TNF, IL - 1β, IL - 6, IL - 10, MCP - 1과 타인의 CASP, 상당한 양의 다음 12시간는뿐만 아니라 장기 suspensions, 예 : 간, 폐, 비장, 신장의 supernatants의 피로 엘리사에 의해 측정할 수 (그림 4).

당신의 실험실, 생존 요금, 세균학 및 시토킨 릴리스에 CASP를 확립하면 CASP의 정확한 성능을 제어 매개 변수로 이동한다. 표준은 모든 실험 설정에 대한 시스템을 읽은 상태로 나중에 이러한 매개 변수가 취할 수 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1A : CASP 후 존속. CASP 수술 다음과 생존의 속도가 삽입된 스텐 트의 직경에 따라 달라집니다. 사망률의 100 % 세율 70 %의 사망률에 16G CASP 결과 및 18G CASP에서 14G CASP 결과 50 % 사망률로 연결됩니다. 섐 CASP 100 %의 생존과 관련된 것입니다. . N = 20/group B : CASPI 수술은 스텐트 제거의 시간에 따라 다음과 같은 서바이벌 요금. 14G CASP 후 3H에서 스텐트 제거 55 %의 사망률로 연결됩니다. 100 % 사망률에 14G CASP 결과 후 9h에서 스텐트 제거 반면, 90 % 사망률에 14G CASP 결과 후 5h에서 스텐트 제거. 100 % 생존에 사기 CASPI (5h) 결과입니다. N = 10/group (섐 CASPI; CASPI 9h), N = 20/group (3H CASPI, 5h CASPI).

figure-protocol-2
그림 2 : CASP 후 복부 원위치 24. 복벽은 각각 16G CASP 또는 가짜 CASP 후 24 시간 제거되었습니다. 가짜 운영 마우스 시터스는 생리 보입니다. 반대로, 부종, 충혈, dilatated 대변하고, Peyer의 패치의 경계에 CASP 결과는 심각한는 복막염 시연.

figure-protocol-3
그림 3 : 세균학. CASP는 수술후 12h 안에 여러 개의 구획 및 내장 박테리아에 의해 기관의 심각한 감염으로 연결됩니다. 세균성 번호는 콜로니 형성 단위 (cfu) 당 ML, 각각으로 제공됩니다. 허위 조작 생쥐에서 가져온 세균성 문화 (표시되지 않음)을 완전히 멸균 수 있습니다. 16G CASP, N = 5/group.

figure-protocol-4
그림 4 : 크린 시토킨. 여러 크린 시토킨 및 chemokines은 장기 supernatants 또한 플라즈마에 감지하고 같은 CASP는 체계적 면역 반응을 트리거합니다. 그림 exemplarily 프로 염증성 크린 시토킨 종양 괴사에게 인자 (TNF)와 인터루킨 6 (IL - 6)뿐만 아니라 주로 안티 - 염증성 IL - 10을 보여줍니다. CASP 후 12h는 놀라운 수준 플라즈마, 간, 폐 및 비장에서 발견하실 수 있습니다. 그러나, IL - 10은 CASP 후 폐 및 비장에서 발견하실 수 없습니다. 섐 작업은 시토킨 분비 (표시되지 않음)에 연결되지 않습니다. 16G CASP, N = 5/group.

토론

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, CASP은 작은 동물에서 수행할 수 있습니다 쉽게 표준 매개 변수에 의해 모니터, 높은 재현성이다, 좋은가 가능성을 읽을 제공하고 긴밀히의 임상 설정을 모방 : CASP는 귀중한 패혈증 모델에 postulated 대부분의 기준을 충족하는 복부 패혈증의 polymicrobial 모델 복부 패혈증. 비교 연구에서 우리는 cecal 내고 주사 (CLP)가 함께 내부 복부 농양 형성의 모델을 보여줍니다 반면 CASP는 일찍 꾸준히 증가 전신 감염 및 염증 (전신 염증 반응 증후군)와 복막염 확산에 이르게 것을 보여줄 수있는 지속과 부 체계 염증의 흔적 (1). CASPI의 기술은 인간에서 가장 중요한 치료 원칙이다 연속 외과 초점 위생과 복막염의 임상 과정을 시뮬레이션할 수있는 가능성을 제공합니다. CASP는 패혈증이나 복막염 주위 모든 질문에 대한 적용 그러므로 패혈증 연구 다루는 모든 분야에 유용 예를 들어 면역학, 약리학, 수술, 집중 치료 의학 등 CASP 모델을 사용하여 패혈증의 다양한 주제에 관한 출판물의 선택 수 있습니다 (1-14) 아래에 주어집니다.

CASP 시작하면, 하나는 연습 정확하고 신속하게 작업을 수행할 필요가있다는 것을 알고 있어야한다. 수술 경험이 도움이 될 수 있지만 필요하지 않습니다. 우리는 CASP의 정확한 성능을 매개 변수로 letality의 탐지를 권장합니다. 대형 스텐트 한 얇은보다 처리하기 쉽습니다와 같은 하나는 14G CASP로 시작한다. 훈련 CASP의 외과의 10 분 내의 마우스를 작동할 수 있습니다. 어떤 실험을 시작하기 전에, 당신은 그 기간이 근처에 있는지 확인합니다. 당신은 수술​​과 어떤 경험을했을 때, 당신은 능력을 확인하는 생존 운동을 실시해야합니다. 14G CASP는 100 % 파괴 장면을 보여 주죠가 발생한다. 저희 연구실에 초심자는 그들이 실험을 시작하기 전에 14G CASP와 100 % 파괴 장면을 보여 주죠를 생성할 수있는 것을 증명해야합니다. 또한, 세균학 및 시토킨 측정은 패혈증을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 당신은 CASP의 microsurgical 단계로 시작에 문제가있다면, 돋보기 안경이나 수술 현미경의 사용이 도움이 될 수 있습니다. 그러나 원칙적으로, CASP 잘 이러한 유틸리티없이도 수행할 수 있습니다. 우리의 생존 요금의 복제의 경우, 같은 재료, 특히 stents (BD Venflon, 아래 참조)가, 사용하는 것이 절대적으로 필요합니다. 그렇지 않으면, 결과의 상당한 변화가 가능합니다. 또한, 우리는 예를 들어,에 대한 외과 의사의 개성에 따라 결과의 차이가있을 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 그러나, 그런 요인의 영향은 작은되어야합니다.

요약, CASP는 밀접​​하게 복부 패혈증의 임상 상황을 일일 실행이, 단순 재현할 가치 패혈증 모델입니다. 그러므로 패혈증 연구의 모든 분야에 적합합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 니코 Zantl, 클라우스 파퍼, 그리고 베른 하르트 Holzmann 감사드립니다. 이 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft, 본 - 나쁜 Godesberg, 독일 (; 할머니 450/10-1 GRK - 840)에 의해 지원되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취액Rompun 0.5 mL와 Ketanest 4.0 mL를 혼합하고, 식염수(0.9%) 5.5 mL를 추가한다. 완전한 마취를 위해 체중 1g당 10 μL를 복강 내로 주사한다.
Rompun (20 mg/ml Xylazine)Bayer AG
Ketanest (25mg/ml Esketamine)Pfizer Pharma GmbH647028001E
BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min)BD Biosciences391457
BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min)BD Biosciences391455
BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min)BD Biosciences391456
Catgut Polyester 4/0 white, 비흡수성Catgut GmbH17218113
Mariderm black 7/0, 비흡수성Catgut GmbH18104900

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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