성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

모기에 RNAi - 중재 유전자 입을 관심의 유전자를 대상으로 특정 dsRNAs의 사전 준비 및 정화가 필요합니다. dsRNA 합성을 위해, 우리는 T7 RNA 시험 관내 전사 반응에서 효소 - 중재의 사용을 만드는 앰비온의 Megascript 키트를 권장합니다. dsRNA 정화를위한, 우리는 Qiagen RNeasy 키트를 권장합니다. dsRNA의 샘플은 계량 3 μg / 물 μL 조정해야합니다. 당신이 필요합니다 다른 자료는 다음과 같습니다 미세 밀고 포셉, 유리 슬라이드, 유리 microcapillary 바늘, microinjector (우리가 드루먼드의 Nanoject II를 사용하여), 감기에 블록, 커버 유리 페트리 접시, 종이 타월과 얼음 양동이 위에 장착 가벼운 현미경 . 당신은 또한 10 %의 자당에 배어 목화 공을 같은 음식 소스와 함께 모기 그들에 적합한 컨테이​​너를 수집하는 방법이 필요합니다.

1. 당신의 모기를 수집합니다. 배터리 구동 흡인기를 사용하면 삽입하고자하는 모기를 수집합니다. 종이 타월이나 면으로도 모기가 저수지 탈출하지 않고 제거할 수있는 노즐​​을 꽂습니다. 추운 기온이 모기를 마취 때문에, 얼음 양동이에있는 저수지 매장 및 이동 막기 위해 모기에 대한 50-10분을 기다립니다. Anesthetization도 감기 방이나 냉장고에 저수지를 삽입하거나 CO _2를 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 5-10분 동안 다음 단계를 계속합니다.
   
   
2. 작업 영역을 준비합니다. 2 평평한 표면 감기에 블록을 설정 ° C와 거기에 유리 슬라이드를 놓으십시오.이 이것은 당신이 주사로 모기가 나머지됩니다 곳입니다. microinjector에 유리 바늘을 첨부하고 원하는 너비로 바늘의 팁을 휴식에 집게를 사용합니다. 넓이가 액체에 대한 충분한 공간이 적당한 속도로 흐르는 수 있도록 충분히 큰지만 주입하는 동안 최소한의 상처를 입힐 수있을만큼 좁고 것이 중요합니다. 좋은 바늘 끝이 약간 구부 정도로 좁은 수 있지만 휴식하지 않습니다. 원하는 출력 볼륨 (RNAi을 위해, 우리는 69 NL을 사용)로 분사 장비를 설정합니다. 잠수함은 샘플에 바늘의 팁 및 제조 업체의 지침을 사용하여 바늘에 액체 샘플을 그립니다. 액체 시료는 dsRNA 솔루션 세균 정지 또는 기타 수 있으며, 사출 과정은 모두에 대해 동일합니다. 접시의 바닥이 완전히 얼음을 연락되도록 얼음 양동이에 유리 페트리 접시를 삽입할 수 있습니다. 당신이 그들을 주입 준비가 될 때까지 당신은 모기를 놓습니다 곳입니다.
   
   
3. 당신의 모기를 준비합니다. 전송 50-100 모기 유리 페트리 접시에 저수지에서. 대부분의 그들이 anesthetized 유지하는 요리의 차가운 바닥과 접촉했는지 확인하고, 단일 레이어로 얇은 위해 집게를 사용하십시오. 사용하지 않을 때는 커버 접시 이러한 모기 커버. 모기의 나머지 anesthetized 유지하는 얼음 양동이에 저수지를 반환합니다.
   
   
4. 추운 블록에 모기를 탑재합니다. 접시에서 빛을 현미경 추위 블록에 장착된 유리 슬라이드에 한 번에 모기를 전송하여 미세 밀고 집게를 사용하십시오. 낫게 다리에 의해 부드럽게 모기를 처리할 수 있습니다. 서 슬라이드 많은 30 모기 나란히, 당신이 microinjector 각 하나를 얻을 각 하나가 감기 슬라이드와 접촉하게 확인하고 확신하고. 당신의 모기가 당신이 따라가는대로하고 주입되지 않은 어떤 알 수 있도록 질서 줄지어 있는지 확인합니다. 냉장 페트리 접시에 나와 다른 모기를 남겨주세요.
   
   
5. 모기의 첫 번째 그룹을 주사. 한 손으로에서 미세 스쳐 스쳐 집게를 잡고 연필처럼 한편의 microinjector를 개최. 필요로 모기를 이동 (부상을 피하기 위해 다리하여 처리) 및 주사로 모기가 안정 유지하기 포셉을 사용합니다. 당신은 다른 측면에서 주사로이 모기의 한쪽을 지원하는 포셉을 사용하는 경우가 최상의 상태로 작동합니다. 조심스럽게 모기의 흉부에 그냥 바늘 끝부분을 삽입합니다. 부상을 최소화하기 위해 표피의 긴장 늦추지 아직 얇은 부분에 주입하는 것이 좋습니다. 또한, 너무 깊이 주입하지 않도록, 당신은 흉부 내부로 끝에만 원하는, 깊은 주사는 생존을 위해서야 큰 상처의 원인이됩니다. 일단 바늘 끝이 위치에, 언론과 dsRNA의 사전 설정된 볼륨을 제공합니다 microinjector 장치의 발을 페달을 놓습니다. 두 번째 또는 두 기다려하고 모기에서 바늘을 제거합니다. 액체 한 방울의 상처 사이트 외부 나타나면 그것이 상처로 흡수 될 수있는 몇 초 정도 기다리십시오. 그것은 몇 초 내에 흡수하지 않는 경우, 그 모기를 버리고 다시 시도하십시오. 당신의 유리 슬라이드에있는 모든 모기에 대한 사출 과정을 계속합니다.
   
   
6. 당신의 모기를 저장합니다. 작업이 완료되면 표시 용기 안에 주입 모기 플레이스 (우리는이 적용 한 파인트 왁스 늘어선 종이 컵을 선호) 그물 및 고무 밴드 및 판지 뚜껑과 보안을 메쉬.
   
   
7. 완료까지 주사를 계속합니다., 슬라이드에 모기를 게재할 계속 주사하고 여러분이 원하는 샘플 크기를 때까지 컵을 전송할 수 있습니다. 어떤 죽음 - 초보자를위한 계정은 많은 모기가 주사의 외상에서 죽게됩니다. 당신의 모기의 거의 100 %가 주사를 살아남을 때까지이 연습 향상됩니다.
   
   
8. 완료되면, 음식 소스와 함께 한잔으로 접으면, 젖은 종이 타월을 장소와 같은 플라스틱 랩 또는 플라스틱 페트리 뚜껑으로 수분을 유지하기 위해 뭔가 컵을 커버. 주입 모기는 젖은 수건으로 제공하고 플라스틱으로 유지 수분이되지 않도록 도움이 될 것입니다 그러니 건조하는 경향이 있습니다.
   
   
9. 배양을위한 환경 제어 챔버에서 모기를 놓습니다.

참고 : 유전자 입을의 효율성이 높은 변수이며 세포와 기관에 의해 증명서 및 단백질 턴 오버 요금 및 dsRNA의 이해 효율을 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 우리는 입을는 1 일 게시 주입처럼 일찍 시작 것을 발견 가지고 있고, 최대 6 일 게시 주입에 마지막으로하실 수 있습니다. 입을를 확인하기 위해 모래 바닥 같은 양적 PCR과 서양 등 증명서와 단백질 검출 방법을 사용합니다.

참고 : 모기 주사와 RNAi - 중재 유전자 입을 기술의 여러 단계에 대한 몇 가지 변형이 있습니다. 일부 변형에 의해 설명되어 있습니다 : Boisson, 외 (2006)와 블랜딘, 외 (2002)...

Efficiency of gene silencing is highly variable and depends on a number of factors including transcript and protein turn-over rates, and dsRNA uptake efficiency by cells and organs. We have found that silencing begins as early as 1 day post injection and can last up to 6 days post injection. Use transcript and protein detection methods such as quantitative PCR and Western blotting to validate silencing.