의 마우스 모델 Utero에 이식

요약

의 마우스 모델 utero에 이식은 태아의 줄기 세포 이식 및 유전자 치료의 가능성 임상 응용을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 도구입니다. 이 프로토콜에서는, 우리는이 기술을 수행하는 일반적인 접근 방법을 제시

초록

utero의 줄기 세포와 바이러스의 이식은 인간의 태아에서 선천성 질환 치료를위한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포의 utero 이식 (IUT)에 성공적으로 여러 가지 다른 조건에서 심한 결합 면역 결핍. ^1,2 환자 치료에 사용되고 있습니다, 그러나, IUT는 성공하지 않고 시도했습니다. ^3이 혼합 결과를 감안할 때, 가용성 간세포 이식 및 유전자 치료의 생물 학적 sequelae을 공부하는 효율이 아닌 인간의 모델이 분야의 발전을 위해 중요합니다. 우리와 다른 야생 형 생쥐 ^4-7과 유전 질환있는 사람 모두 utero에 이식 조혈 줄기 세포의 성공적인 engraftment에 영향을 미치는 요인 연구를 IUT의 마우스 모델을 사용하고 있습니다. ^8,9 태아의 환경은 또한에 대한 상당한 이점을 제공 utero의 유전자 치료에 성공. 예를 들어, adenoviral ¹⁰ 전달, 태아에 ^12,13 adeno - 관련 ¹¹ retroviral, ¹⁰ 바이러스 및 lentiviral 벡터는 장기적인 유전자 발현과 주입의 사이트에서 멀리 떨어진 여러 장기의 도입 결과입니다. utero에 유전자 치료는 따라서 이러한 근육 영양 장애 또는 낭성 섬유증과 같은 단일 유전자 질환에 대한 가능한 치료 전략으로 간주됩니다. IUT의 또 다른 잠재적인 장점은 특정 항원에 면역 내성을 유발하는 능력입니다. 으로 혈우병,이 단백질에 내성의 초기 개발 결과에 팩터 IX의 도입과 생쥐에서 본. ¹⁴

잠재적인 인간의 치료법을 조사에서의 사용뿐만 아니라, IUT의 마우스 모델은 발달과 줄기 세포 생물학의 기본적인 질문을 연구하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 유도 또는 억제 특정 유전자 발현을 정의 임신 성 단계에서 발달 경로를 조작하는 여러 작은 분자를 제공할 수 있습니다. 이러한 변경의 영향은 초기 이식 후 다양한 timepoints에서 평가하실 수 있습니다. 또한, 하나는 비 조사 및 교란되지 않은 호스트 환경에서 줄기 세포 분화 연구를 태아 환경에 pluripotent 또는 혈통 특정 전구 세포를 이식 수 있습니다.

IUT의 마우스 모델은 이미 면역학 분야, 그리고 발달과 줄기 세포 생물학 내에 많은 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 동영상 기반의 프로토콜에서는, 우리는 마우스 fetuses의 IUT를 수행하기위한 단계별 접근 방식을 설명하고 중요한 단계이 기술의 잠재적인 함정을 설명합니다.

프로토콜

1. 사출 Pipettes의 준비

1. 유리 피펫의 분리가 15 초 (교정에 대한 제조 업체의 지침을 참조) 내에서 발생하는 등 피펫 끌어당기는을 보정합니다. 피펫은 구분 테이퍼를해야합니다.
2. 테이퍼의 처음부터 피펫의 끝에 거리는 1.05cm에 1.04cm입니다 같은 피펫의 끝을 잘라. 피펫의 길이는 피펫 오리피스의 구경에 반비례합니다. 이상 피펫을 만드 는게 아니라 주사 중에 파손 더 쉽습니다 약한 팁 결과는 점에 유의하십시오.
3. 피펫을 만드는 다음 단계는 다이아몬드가는 바퀴에 팁을 선명하여 부드러운 베벨을 만드는 것입니다. 적절한 크기로 피펫을 절단 당시, 피펫은 종종 바퀴에 피펫을 게재할 때 사용해야 그 끝에 자연 베벨과 함께 나옵니다. 이 과정에서, 그것은 부드럽게 선명하게 바퀴에 피펫을 휴식과 정기적으로 피펫 아직도 바퀴를 감동이다 (베벨이 부드럽게되면서, 그것은 선명하게 바퀴와 접촉을 잃게됩니다) 확인을 다시 평가하는 것이 중요합니다.
4. 베벨은 부드러운되면, 피펫 팁은 (그림 1) 날카롭게해야합니다. 그것이 더 이상 선명하게 바퀴를 만지지 않습니다 그러한 피펫을 향상, 그것이 10-50도로 시계 방향으로 회전하고, ~ 10 초 동안 회전 선명하게 바퀴에 피펫을 돌려 놓으십시오. 선명하게 바퀴에서 피펫을 철회하고 지금은....

토론

50 년 전, 빌링햄, 브렌트, 그리고 Medawar 외국 단백질에 면역 내성을 유발 생쥐에 utero 이식에 사용됩니다. ^16은 그 이후,이 기술의 몇 가지 유사 콘텐츠는 면역학 및 줄기 세포 생물학 질문을 해결하기 위해 사용되었습니다.

여기에 자세한 프로토콜은 IUT에 가장 접근 방법 중 하나입니다. 태아 간은 쉽게 시각 목표를 제공하며 포털과 간장 정맥을 통해 순환 체계에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 몇 가지 수정이 원하는 사출의 타이밍과 위치를 최적화하기 위해 설명되었습니다. 자궁이 투명하지 않기 때문에 예를 들어, E13.5 미만 fetuses에 주사 더 어려울 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 개발에 앞서 이벤트를 공부하기 위해 필요한 경우, 초음파 유도 주사는 특정 조직을 대상으로 사용할 수 있습니다. ¹⁷ 초음파지도는 또한 심장이나 폐 등 특정 기관,에 주사를 직접하는 데 유용합니다. vitellin.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피펫	Kimble Chase	71900-100
피펫 풀러	Sutter Instrument Co.	Model P-30
마이크로인젝터	Narishige International	IM-300
피펫 샤프너	Sutter Instrument Co.	Model BV-10