이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다 살모넬라균 형광을 사용하여 현장에서 하이브리드화 (물고기).
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 살모넬라균 종의 급속한 문화 독립적인 감지를위한 현장 하이브리드화 (물고기)에서 테이프 형광 다음 토마토와 다른 신선한 농산물 표면의 접착 테이프 기반의 샘플링을위한 간단한 방법을 설명합니다. 셀 - 충전 테이프도 검색하기 전에 고체 상 농축을위한 선택적 한천에 얼굴을 아래로 둘 수 있습니다. 또는 낮은 볼륨 액체 enrichments (액체 표면 miniculture)는 유동세포계측법를 통해 물고기와 분석에 의해 다음이 아닌 선택 국물에있는 테이프의 표면에 수행할 수 있습니다. 시작하려면, 살균 접착 테이프는 신선한 농산물과 접촉을 가지고있다, 부드러운 압력이 적용되고 테이프는 실제로 이러한 표면에 존재하는 미생물을 추출, 제거됩니다. 테이프 유리 현미경 슬라이드에 쓰는 쪽까지를 탑재하고 샘플 세포는 포르말린 (30 분)과 탈수 10 % 등급 에탄올 시리즈 (50, 80, 및 95 %, 3 분 각 농도)를 이용하여 고정합니다. 다음 셀 충전 테이프는 살모넬라균 타겟 DNA 프로브 칵테일을 포함하는 버퍼 발견하고 15 hybridized 아르 - 55시 30 분 ° C, 언바운드 프로브를 제거하는 세척 버퍼 린스 간단한 다음. 자기편, 물고기 표시된 전지는 다음 형광 현미경을 사용하여 볼 수있는 DNA 염색 4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 및 결과 counterstained 있습니다. 고체 상 농축 들어, 셀 충전 테이프는 적절한 선택 한천 표면에 얼굴을 아래로 배치하고 위에 설명된대로 피시 앤드 현미경 다음 살모넬라균의 microcolonies의 현장 성장에 수 incubated 수 있습니다. 액체 표면 miniculture 들어, 셀 충전 테이프 끈끈한 측면을 배치하고 실리콘 재관류 챔버 적용되도록 테이프 및 현미경 슬라이드 양식 물이 꽉 챔버로의 하단 Trypticase 콩의 작은 볼륨 (≤ 500 μL) 국물 (TSB)가 도입됩니다. 입구 포트는 봉인되고 회의소는 35 incubated 있습니다 - 37 ° C, 테이프 추출한 미생물의 성장 기반 확대를 수 있도록합니다. 부화 후, 입구 포트 unsealed 있으며, 세포 분리 및 혼합 활발한 뒤로와 앞으로 pipetting, 원심 분리를 통해 수확와 10 %에서 해결된 중성 포르말린 버퍼. 마지막으로 샘플은 hybridized과 살모넬라균 종의 존재를 나타내기 위해 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다. 여기에 설명한 바와 같이, 우리의 "테이프 - 물고기"접근 방식은 토마토 표면에 간단하고 빠른 샘플링과 살모넬라균의 검출을 제공할 수 있습니다. 또한 시금치와 잘라페노 후추를 포함한 신선한 농산물의 다른 유형을 샘플링이 접근 방식을 사용하고 있습니다.
프로토콜
1. 무균 접착제 테이프로 표면 샘플링
- 샘플링에 사용하는 테이프를 선택합니다. 상용 곰팡이 - 테이프 또는 콘 - 전술 - 이건 샘플링 테이프 사용의 용이성에 대한 살균 및 특수 포장됩니다. 그러나, 우리는 투명 (광학 취소) 일반 사무실 테이프도 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
- 접착 테이프 10cm의 조각 (종이 템플릿을 사용할 수 있습니다)의 비 끈적끈적한 측면에 1cm 두 사각형을 그릴 수있는 영구 마커를 사용합니다. 이것은 테이프의 부분은 음식이나 환경 표면을 샘플하는 데 사용되었습니다 어떤 지적을위한 시각적인 가이드 역할을합니다.
- 샘플로 표면을 향하게 쓰는 측면과 "C"모양의 테이프 루프를 형성합니다. 이렇게하려면 뒤로 (비 끈적 쪽) 테이프 (그림 1)에 그려진 사각형에 대한 엄지와 가운데 손가락 및 위치 검지로 쓰는 끝을 잡고.
- 샘플로 표면에 테이프를 놓고 부드럽게 표면에 대한 표시 영역을 누르십시오. 테이프의 가장자리를 발표하지 않고, 테이프의 끈적한 면이 거품을 피하기 위해, 샘플 표면 전체 접촉할 수 있도록 검지 손가락을 사용합니다.
- 도 동작을 사용하면, 천천히 신체 표면 바운드 미생물을 추출, 멀리 샘플에서 테이프를 가져옵니다. 일반 투명 사무실 테이프를 사....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
생산 표면에 병원균의 검출을위한 간단하고 빠른 방법은 시의 적절하고 실질적인 데이터를 제공함으로써 식인성 질환을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접착제 테이프 기반 샘플링 방법은 1950 년대 이후, 환경 임상 및 식품 미생물학에서 사용하고 직접 현미경 검사 또는 고체 미디어에 점착 성의 미생물의 양도 다음, 미생물의 제거를위한 표면에 '스카치'스타일 테이프를 눌러 포함되었습니다 성장 (Barnetson & 밀른, 1973; 에드워즈 & 하트먼 1952; Evancho 외, 2001;. 반갑습 외, 1980;. Lakshmanan & 샤프너, 2005; Langvad, 1980). 최근 수정 석조 기념물 (라 Cono & C. Urzì, 2003)의 표면을 colonizing 미생물의 문화 독립적인 분석을 위해 현장 하이브리드화 (물고기)의 형광과 테이프 기반 샘플링의 조합을 설명했다. 우리는 빠른 샘플링과 토마토,.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품에 대한 자금은 BFBS로 성장 아이오와 값 기금 보너스에 의해 제공되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fungi-Tape 샘플링 테이프 | Scientific Device Laboratory | 745 | http://www.scientificdevice.com/ |
| Con-Tact-It 샘플링 테이프 | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | |
| 투명 사무용 테이프, 일반용 | 다양함 | 광학적으로 투명하고 고유 형광이 낮아야 함 | |
| 식품 표면 | 지역 식료품점 | 본 실험에서는 토마토(–) (왁스나 오일 처리를 하지 않은 가지 달린 빨간 토마토–)를 사용함 | |
| Trypticase Soy Broth | Difco Laboratories | 211768 | 비선택적 액체 표면 미니 배양 농축용 |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 한천 베이스 | Difco Laboratories | 223420 | Salmonella-선택 한천(XLT-4)용 |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 한천 보충제 | Difco Laboratories | 235310 | Salmonella-선택 한천(XLT-4)용 |
| 포르말린 용액 | Sigma-Aldrich | HT5011 | 10% 용액, 중성, 완충액 (세포 고정액) |
| 절대 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023 | 분자 생물학 등급 (혼성화 전 탈수용) |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브 | 다양함 | RNase 및 DNase-free | |
| 현미경 슬라이드 및 커버 글라스 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| NaCl 용액 | Sigma-Aldrich | S5150 | 분자 생물학 등급, 5M 용액 (혼성화 완충액 성분) |
| Tris-EDTA 완충 용액 (100X 농축액) | Sigma-Aldrich | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (혼성화 완충액 성분) |
| 소듐 도데실 설페이트 용액 | Sigma-Aldrich | L4522 | 18 megohm 물에 희석한 10% 용액 (혼성화 완충액 성분) |
| Sal3 및 Salm-63 올리고뉴클레오타이드 프로브 | Integrated DNA Technologies | 6-carboxyfluorescein (FAM) 또는 Texas Red (현미경 관찰용) 또는 Cy5 (사이토메트리용)로 5’-표지됨, HPLC 정제됨 | |
| 가변 속도 마이크로 원심분리기 | 다양함 | 프로토콜에 명시된 RCF 값을 얻기 위해 로터 직경을 이용하여 필요한 RPM을 계산하여 사용 | |
| CoverWell 퍼퓨전 챔버 | Grace Bio-Lab Inc. | PC1R-2.0 | 비멸균 |
| 겔 로딩 피펫 팁 (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 05-408-151 | 작은 샘플링 포트에 쉽게 접근하고 챔버 내에서 기동성을 높이기 위한 길고 얇은 팁 |
| 알루미늄 히트 블록 또는 정밀 제어 가열 스테이션 | 다양함 | 본 실험에서는 Eppendorf Thermomixer R 드라이 블록 가열 및 냉각 쉐이커를 사용함 | |
| Bambino 미니 혼성화 오븐 | Boekel Scientific | Model 230300 | 슬라이드를 50 ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣어 혼성화하며, 열전달이 직접적이지 않음 |
| Slide Moat 슬라이드 혼성화 장치 | Boekel Scientific | Model 240000 | 유리 슬라이드를 통해 신속하고 직접적인 열전달 제공 |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 포함된 Vectashield H-1200 마운팅 용액 | Vector Laboratories | H-1200 | 현미경 관찰 중 형광 소광을 최소화하며 DAPI 대조 염색 제공 |
| 형광 현미경 | 다양함 | 본 실험에서는 Leitz Laborlux S를 사용함 | |
| 디지털 카메라 | 다양함 | 본 실험에서는 Canon PowerShot A640 카메라를 사용함 | |
| 이미지 획득 소프트웨어 | 다양함 | Axiovision 소프트웨어 v. 4.6 (Carl Zeiss) 사용 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | 이미지의 최소 처리용 (서로 다른 채널에서 촬영된 이미지의 중첩) | |
| 유세포 분석기 | 다양함 | 적색(647 nm) 여기광을 사용하는 FACSCanto 유세포 분석기 (BD Biosciences, San Jose, CA) 사용 | |
| 유세포 분석 소프트웨어 | 다양함 | FlowJo 소프트웨어 v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) 사용 |
참고문헌
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
