Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

요약

본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

초록

G - 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 일곱 transmembrane 단백질 제품군에 속하는 및 세포내 반응하는 세포 신호 전달을 중재. GPCRs 제어 등 chemotaxis와 같은 다양한 생물 학적 기능, 세포내 칼슘 릴리스 heterotrimeric G - 단백질 ^1-2 통해 리간드에 의존적인 방식으로 유전자 규정. 리간드 바인딩은 순환 아데노신 monophosphate (CAMP), 이노시톨의 삼인산 (IP3)와 diacyl 글리세롤 (DG)로 두번째 사자의 수준을 조절 heterotrimeric G - 단백질의 활성화로 이어지는 conformational 변화 일련의 유도. 수용체 리간드 바인딩의 활성화와 함께 수반하는 또 desensitization, 격리 및 / 또는 국제화를 통해 신호 수용체를 자제하는 이벤트의 시리즈를 시작합니다. GPCRs의 desensitization 과정은 G - 단백질 수용체 kinases (GRKs)과 β - arrestins ³ 이후 결합하여 수용체의 인산화 통해 발생합니다. β - arrestins은 cytosolic 단백질이며 수용체 내면화 ^4-6을 촉진하여가 (대부분의 경우) phosphorylated 수용체에 결합, GPCR 활성화에 막으로 이동시키다.

와 LTB ₄ 수용체 2 (BLT2, 낮은 친화 수용체, Leukotriene B ₄ (LTB ₄₎ GPCRs, LTB ₄ 수용체 1 (고친 화성 수용체 BLT1)을 통해 arachidonic의 산성 경로 및 mediates의 행동에서 파생된 프로 염증성 지질 분자이다 ) ^7-9. LTB ₄ BLT1 경로는 천식, 관절염 및 죽상 경화증 ^10-17, 등 여러 가지 염증 질환에 중요한 것으로 표시되었습니다. 현재 신문은 LTB ₄ 유도된 백혈구 마이 그 레이션 및 BLT1의 상호 작용 β - arrestin과, 현미경 이미징 ^기술을 사용하여 ^18-19 살 세포 수용체의 translocation을 모니터하기 위해 개발된 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마우스에서 돌기 세포를 파생 골수는 격리 및 이전에 ^20-21을 설명한 교양되었습니다. 이러한 전지는 LTB ₄ 유도된 세포 마이 그 레이션을 보여주는 라이브 셀 이미징 방법으로 테스트되었습니다. 인간 BLT1는 녹색 형광 단백질 (β - 도착지 - GFP)로 태그가 C - 말단과 β - arrestin1에서 적색 형광 단백질 (BLT1 - RFP)를 지정하여 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 세포 라인에 plasmids 모두 transfected했습니다 ^18-19. 이러한 단백질 및 현지화 사이의 상호 작용 속도론는 라이브 세포 영상 현미경을 사용하여 모니터링할되었습니다. 현재 논문의 방법론은 라이브 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 기능 반응을 조사하기 위해 미세 기술의 사용을 설명합니다. 현재 종이는 또한 수용체의 반응 속도론과 cytosolic 단백질 상호 작용을 결정하는 형광 강도를 정할 Metamorph 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다.

프로토콜

방법론

현미경에 대한 설명

라이브 셀 이미징 실험 이클립스 TE300 니콘 인버티드 현미경에 부착된 TE - FM 에피 형광 시스템을 사용하여 수행된. 현미경 난방 무대를 갖춘. 멋진 스냅 HQ 디지털 B / W CCD (로퍼 과학) 카메라와 LAMDA 10-2 광학 필터 체인저 (서터 악기 회사) 현미경에 첨부되어 있습니다. 여기 및 발광 파장은 필터 바퀴 제어 및 Lamba 10-2 필터 휠 컨트롤러에 의해 제어되며, 셔터 인 스트 루먼트 (주) 노출 시간이 500 MS 충분히 살 세포에 RFP 또는 GFP를 볼 수 있어야합니다. 하드웨어 제어와 이미지의 취득 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어됩니다. EGFP / DsRed 듀얼 이색성, 채도 기술, 현재 연구에 대한 필터의 선택은, 필터 S480/20x, S525/40m 및 S565/25x, GFP 및 RFP에 대한 S620/60m, 각각을 설정하고 있습니다. 이 필터 휠은 여섯 필터 세트 수용할 수 있습니다. 현미경는 조이 스틱과 함께 이전 Proscan 무대 컨트롤러와 연결되어 있습니다. 이러한 모든 하드웨어 첨부 파일 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어하실 수 있습니다. 현미경도 micropipettes를 잡아 Microma....

토론

라이브 셀 이미징들은 실시간으로 발생과 같은 특정 단백질의 기능과 상호 작용을 설명하는 강력한 도구입니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 명확하게 LTB ₄ 돌기 세포의 빠른 마이 그 레이션을 일으킬 수 보여줍니다. 이러한 방법은 다양한 세포 유형 LTB ₄ 기능의 측면뿐만 아니라 확장, 그들은 유사한 방법을 다른 chemokines의 다양한 적용 및 다른 백혈구 하위 집단에 대한 chemotactic 대리인으로서의 효능을 테스트 할 수 있습니다. 이 시스템의 형광 이미징 실시간으로 신호 이벤트를 모니터링하실 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 또한 적절한 flurochromes 태그 분자를 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (걱정)에 따라 생체내에서 분자의 꽉 연결을 검사하기 위해 확장할 수 있습니다.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐 염기성 백혈병 세포주(RBL-2H3) 또는 HEK293 세포.	ATCC	CRL-2256
델베코’수정된 Eagle 배지’배지 (DMEM)	Invitrogen	11995
페놀 레드 프리 RPMI 또는 DMEM	Invitrogen	11835-030
소 태아 혈청	Invitrogen	16000-044
L-글루타민 (200 mM)	Invitrogen	25030
페니실린-스트렙토마이신 (10000 U/mL)	Invitrogen	15140
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, 액체	Invitrogen	25300
HEPES (1M)	Invitrogen	15630
35 mm 멸균 유리 커버슬립 바닥 Fluoro 디쉬 (두께 0.17 mm) (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
멸균 Gene Pulser 큐벳 (0.4 cm 전극 간격) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
Gene Pulser II 전기천공기	Bio-Rad
Nikon Eclipse TE300 도립 현미경에 장착된 TE-FM 형광 시스템	Nikon 기기
Metamorph 소프트웨어	범용 이미징
수직형 마이크로피펫 풀러	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
유압식 마이크로매니퓰레이터 MO-188NE	Narishige International
거친 수동 조작기, MN-188NE	Narishige International
<강력한>cDNA 구축물:
C-말단에 적색 형광 단백질이 태깅된 G-단백질 결합 수용체의 cDNA (hBLT1-RFP)	Jala 등 2005
GFP가 태그된 세포질 단백질의 cDNA (β-arrestin1-GFP(본 연구에서 사용됨).	Jala 등(2005)