방법 논문

회로 기판과 생물 세포막을 모델링하고 Axons에 전기 신호를 측정 : 학생 실험실 연습을

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DOI:

10.3791/2325

⸱

2011년 1월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto

이 논문에서

요약

이것은 생물 세포막은 전기 모델을 사용하여 구분할 수있는 방법에 대한 데모입니다. 우리는 또한 학생 중심의 연구소에 대한 왕새우의 복부 신경 코드에서 작업 잠재력을 기록 절차를 보여줍니다.

초록

이것은 전기 모델을 생물 학적 세포막을 특성화하는 데 사용할 수있는 방법에 대한 데모입니다. 이 운동은 또한 전기 생리학에서 사용 biophysical 용어를 소개합니다. 동일한 장비는 라이브 준비 등 멤브레인 모델에서 사용됩니다. 격리된 신경 코드의 일부 속성이 조사 위치 : 신경 행동 잠재력, 뉴런의 채용, 그리고 환경 요인에 신경 코드의 응답합니다.

프로토콜

1. 서론

1.1) 배경

전기 회로에 대한 기초 지식은 생리학적 실험 및 이론의 많은 측면을 이해하고 개념화하는 데 유용한 도구가 됩니다. 본 실습은 전압원, 전기 저항 및 전기 커패시턴스와 관련된 몇 가지 일반 원리에 익숙해지는 것을 목표로 합니다. 이러한 입문 개념은 시냅스 전달 및 신경 섬유를 따른 전기 신호의 전파와 같은 현상을 이해하기 위한 배경 지식을 제공합니다.

주의 사항: 금속 전선과 저항기로 구성된 일반적인 일상 회로에서 전류는 음전하를 띤 전자에 의해 운반됩니다. 반면, 생물학적 시스템에서 전류는 하나 이상의 양전하 또는 음전하를 가질 수 있는 이온에 의해 운반됩니다. 관례적으로 전류는 양극에서 음극으로 흐르는 것으로 정의합니다(실제로 전자는 그 반대 방향으로 이동하지만 말입니다).

회로의 구성 요소는 생체 조직의 전기적 특성과 일부 경우에는 연구에 사용되는 무생물 객체(전극 등)의 특성을 나타냅니다.

실습을 진행하면서 결과와 계산 내용을 기록해 두십시오.

1.2) 일반 원리

직류가 흐르는 전기 회로의 기본 특성은 옴의 법칙(Ohm's Law)으로 설명됩니다.
V = IR
여기서 V = 전압, 단위는 볼트(V)
I = 전류, 단위는 암페어(A)
R = 저항, 단위는 옴(Ω)

이 법칙은 전극으로 관찰되는 신경 세포의 전위를 규정합니다. 먼저 옴의 법칙과 생물학적 물질에 대한 적용 사례를 시연하겠습니다.

1.3) 재료

항목양
브레드보드1
저항기: 330 K Ω1
10 K Ω12
3 K Ω6
2 K Ω1
10 K Ω6
4.7 K Ω1
2.2 K Ω1
1.5 K Ω1
1 KΩ1
510 Ω1
30 Ω1
20 Ω1
150 Ω1
10 Ω1
축전기: 0.1 μF6
: 10 μF6
전선12
PowerLab1
PowerLab 출력 리드선1
PowerLab 입력 리드선1
전압계 (전류 측정 가능)1

저항기 색코드 표

색상손가락/발가락
검정색0
브라운1
빨간색2
오렌지3
노란색4
녹색5
파란색6
보라색7
회색8
흰색9
은10% 허용 오차
금5% 허용 오차

1st 밴드 - 1st 손가락
2nd 밴드 - 2nd 손가락(또는 발가락)
3rd 밴드 - 0의 개수
4th 밴드 - 허용 오차

회로 분석 및 테스트를 위한 컴퓨터, 멀티미터, 브레드보드가 포함된 전자 실험 설정.
그림 1: 시스템 구성. 컴퓨터, 브레드보드 및 출력 자극기가 포함된 PowerLab.

본 실험에서는 PowerLab 시스템(AD Instruments, Australia 사의 PowerLab 인터페이스)을 전압원으로 사용합니다. PowerLab의 USB 케이블을 컴퓨터에 연결하고 PowerLab의 전원을 켠 뒤, 바탕 화면에서 LabChart 프로그램을 엽니다. "New File"을 선택하십시오. 여러 개의 기록 채널이 표시된 창이 나타납니다. 상단의 "Setup"을 선택하고 "Channel Settings"를 클릭하십시오. 창의 왼쪽 하단 모서리에서 채널 수(Number of Channels)를 1로 줄이고, 채널 1의 범위(Range)를 5 V로 변경하십시오. 두 개의 미니 훅 리드가 달린 Stimulator 케이블을 PowerLab의 출력(Output) 포트에 연결하십시오. 빨간색 커넥터 케이블은 양(+)의 출력 포트에, 검은색 커넥터 케이블은 음(-)의 출력 포트에 연결합니다. 다음으로, PowerLab의 전력 출력, 주파수 및 펄스 지속 시간을 변경해야 합니다. 이를 위해 "Setup"을 선택한 다음 "Stimulator Panel"을 선택하십시오. 실험의 첫 번째 부분에서는 1.5 V의 긴 펄스가 필요하므로 진폭(amplitude)을 0.75 V로 조정하십시오. 이렇게 하면 1.5 V의 범위가 설정됩니다(PowerLab은 +0.75 V와 -0.75 V 사이에서 변동하는 전압을 방출합니다). 주파수(0.5 Hz)와 펄스 지속 시간(1 s)을 설정하십시오.

전기영동 도식; DNA 분리 과정; 겔 레인의 분자량 차이 표시
그림 2: 브레드보드 회로도. 측면을 따라 배치된 색상 스트립은 동일한 색상별로 하나의 단위로 연결되어 있습니다. 중앙의 두 수평 열은 각 행에 대해 절반씩 연결되어 있으나, 중앙선을 가로지르거나 측면 스트립으로 연결되지 않습니다. 중앙의 각 행은 다음 행과 독립적입니다.

브레드보드를 사용할 때, 입력 및 출력 리드선을 위해 양쪽에 두 개의 열이 사용됩니다. 일반적으로 양극(+)은 모든 공간이 서로 연결되어 있는 오른쪽 양극 열에 연결합니다. 음극(-) 입력은 브레드보드의 반대편에 연결하며, 여기에서도 마찬가지로 한 열의 모든 공간이 서로 연결되어 있습니다. 두 열 세트 사이의 중앙에는 5개의 셀로 구성된 여러 행이 있으며, 각 행은 서로 독립적입니다. 5개 셀로 이루어진 한 행 내의 모든 셀은 서로 연결되어 있지만, 다른 행과는 격리되어 있습니다. 그림 2를 참조하십시오. 강조 표시된 영역은 브레드보드의 어느 부분이 서로 연결되어 있는지를 보여줍니다. 브레드보드 사용법에 관한 유용한 동영상은 http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related에서 온라인으로 확인하실 수 있습니다.

실습 1

옴의 법칙을 사용하여 다음 회로에 흐르는 전류를 계산하십시오.
전기 회로도, 정적 평형, 1.5V 배터리, 150Ω 저항기, 전류 분석.
전류 (네트워크 1): ________________A

실습 2
위 회로(네트워크 1)에서 저항기 양단의 전압, 저항기의 저항값 및 흐르는 전류를 측정하십시오.

정전용량 값을 표시하는 디지털 멀티미터; 전기 측정 및 진단에 필수적임.
그림 3: Wavetek Meterman 전압계.

1500 Ω 저항기를 사용하여 브레드보드에 네트워크 1을 재구성하십시오. PowerLab이 전압원(1.5 V) 역할을 합니다. 전압, 전류 및 저항의 측정은 전압계로 수행합니다. 전압계가 정확한 데이터를 수집하려면 빨간색과 검은색 프로브가 모두 회로의 노출된 전선에 접촉되어야 합니다. 또한, 다이얼을 각 개별 실험 설정의 스케일에 적절한 범위의 DC 전압으로 조정해야 합니다. 전압을 측정할 때는 전압계의 두 프로브를 저항기의 양끝에 접촉시키십시오. (전압 강하가 아닌) 저항기의 저항을 측정할 때는 전압원을 분리하고 다시 두 프로브를 저항기에 접촉시키십시오. 전류를 측정하려면 전압계가 회로에 직렬로 연결되어야 하며, 전류 흐름에 따라 빨간색과 검은색 프로브가 적절하게 방향 설정되어야 함에 유의하십시오.

전압 (회로 1): ________________V
저항 (회로 1): ________________Ω
전류 (회로 1): ________________A

이제 전압계로 수행했던 것과 동일하게 Power Lab을 사용하여 네트워크 2(네트워크 1과 동일하지만 브레드보드에 구성됨)의 전압을 측정하십시오. 전압계를 분리하고 빨간색과 검은색 클립이 달린 전압 측정 프로브의 리드선을 연결합니다. 다음으로 커서를 사용하여 화면 우측의 "Channel 1"을 클릭하십시오. 클릭 후 "input amplifier"로 이동합니다. 그런 다음 상자에서 "differential" 버튼을 클릭하고 범위를 5 V로 설정하십시오. "OK"를 클릭하여 변경 사항을 저장합니다.

데이터를 수집하려면 (우측 하단 구석의) "Start"를 클릭하십시오. 전압 편향을 측정하기 위해 언제든지 중단할 수 있습니다. 수집된 전압을 측정하려면 "Stop"을 클릭하고, (좌측 하단 구석의) "M" 커서를 드래그하여 기선(baseline)으로 이동시키십시오. 그런 다음 자유 커서를 전압 트레이스의 상단으로 이동시켜 진폭을 측정하십시오. 전압 변화(ΔV)를 읽고 데이터를 종이에 기록하십시오. 독립형 전압계로 결과를 확인할 수 있습니다.

1.4) 직렬 연결에서의 저항과 전도도

전압 분배기의 원리: 직렬로 연결된 모든 저항의 총합에 걸리는 전압 강하는 전원 전압과 같다. 각 개별 저항에 걸리는 전압은 해당 저항이 전체 저항에서 차지하는 비율에 따라 결정된다. 따라서 다음과 같다:
전압 분배기 방정식; V1=V(source)R1/(R1+R2); 회로 분석 공식; 전자 설계.
한 쌍의 저항기는 각각의 저항값 비율에 따라 전압을 분배합니다.

실습 3

회로 3의 각 저항에 걸리는 전압 강하를 계산하십시오. 1.5V 전원을 연결한 상태에서 전압계와 PowerLab 소프트웨어를 사용하여 실제 전압을 측정함으로써 계산 결과가 맞는지 확인하십시오.
전기 회로도, 1.5V 전원, 저항 R1 510Ω, R2 1500Ω, 정적 평형 분석.
회로 3. 위에 표시된 두 개의 저항기를 사용하십시오.

계산됨:측정값:
전압 (R 양단)1):_______V전압 (R 양단)1): ________________V
전압 (R 양단)2):_______V전압 (R 양단)2): ________________V

1.5) 샘플 생물학적 응용:

활성 신경 세포의 내부와 외부 용액의 서로 다른 전기적 특성은 전압 분배기의 한 사례를 제공합니다. 이 생물학적 회로는 외부 전극을 통해 측정된 기록을 통해 탐구할 수 있습니다. 이온이 유입되는 신경 세포의 활성 영역은 전압원 역할을 하며, 전류는 이 영역에서 세포 내부를 따라 흐른 뒤 외부 용액을 통해 되돌아옵니다. 따라서 전위가 다른 막의 두 지점 사이에는 전류가 흐르며, 이는 필연적으로 섬유 내부와 외부에서 동일합니다. 이때 내부의 저항이 외부보다 크기 때문에 가장 큰 전압 강하는 여기서 발생합니다.

시스템과 그에 상응하는 등가 회로를 고려하십시오(그림 4: A. 및 B.).
신경세포 전류 측정 도식; 오실로스코프 연결, Ro 및 Ri 저항 경로 표시.
등가 회로:
120 mV 전원, 저항 Ro, Ri, 오실로스코프가 포함된 회로도; 전압 및 전류 흐름 측정.
그림 4: A (상단). 생체 세포막을 가로지르는 전류의 전기적 흐름. B (하단). 등가 전기 회로. 전압원(120 mV)은 신경 세포의 활동 전위에 의해 생성된 막전위임.
참고: R0 및 Ri 전원의 위치로 인해 실제로는 (병렬이 아니라) 직렬로 연결되어 있습니다. 이 회로의 등가 회로도는 다음과 같습니다.
전자 회로도; 전압 분배기, 저항 \(R_0 = 10^4 \Omega\), \(R_t = 10^6 \Omega\).
그림 5: 그림 4A에 대한 대체 등가 전기 회로.

연습 문제 4.
다음 조건이 주어졌을 때:
Vm, 막 전위 = 120 mV
Ri, 내부액의 저항 = 106 Ω
R0, 외부액의 저항 = 104 Ω
전극 A와 B 사이의 전위인 V0를 계산하시오.
V0: ________________V

실습 5.

네트워크 4(아래 참조)를 사용하여, 각 저항(R)에 걸리는 전위차를 측정하십시오.0 및 Ri).
회로 4. 4.7 K Ω 및 10 K Ω 저항기를 1.5 V 전원과 직렬로 연결하십시오.
1.5V 배터리와 4.7KΩ, 10KΩ 저항기를 포함하여 전기 회로망을 보여주는 회로도.
전압계로 전압을 측정하십시오.
전압 (R 양단)0): ________________V
전압 (RAcross R)i): ________________V

네트워크 5 : R0 = 1 K Ω인 점을 제외하고 네트워크 4와 동일함
네트워크 5에서는 외부 저항이 훨씬 낮으므로(많은 양의 액체나 비활성 조직이 전극을 단락시키는 것과 유사함), 외부 저항을 높이기 위해 공기 중 또는 절연유 아래에서 신경을 기록하는 것이 중요하다는 점에 유의하십시오.
전압 (R0 양단): ________________V
전압 (Ri 양단): ________________V

1.6) 직렬 및 병렬 연결에서의 저항과 전도도

생물학적 응용 예시:

직렬 및 병렬 저항의 좋은 예는 화학적 전달 시냅스의 전기적 구성입니다. 시냅스 간극의 션트 효과(shunting effect)로 인해 대부분의 시냅스에서는 전기적 전달이 불가능합니다. 하지만 이러한 션트는 시냅스 전 막에 큰 전위가 형성되어 그에 따른 신경전달물질 방출이 가능하게 하는 데 아마도 필수적일 것입니다.

시냅스 전달 도식; 시냅스 후 막, 세포 발화 경로, 전기 저항.
그림 6: 시냅스를 통한 전기화학적 흐름 모델.
네트워크 분석을 위한 저항(Rm1, Rm2, Rm3, Rs)이 포함된 전기 회로도.

살아있는 조직에서는 세포막과 제한된 세포 외 공간에서 상당한 전기 저항이 형성된다는 점에 유의하십시오. 세포질이나 배양액과 같이 상대적으로 넓은 유체 공간은 유의미한 저항을 나타내지 않습니다.

실습 6.
네트워크 6(위의 회로도 및 회로 기판 참조)은 화학적 전달 시냅스의 아날로그 모델입니다. 전기적 전달 시냅스에서는 시냅스 틈(분로 저항 Rs)이 제거되어 전류가 Rm1과 Rm2를 통해 시냅스 전 세포에서 시냅스 후 세포로 직접 흐른 다음 Rm3를 가로질러 흐르게 됩니다. 네트워크의 감쇠는 다양한 저항값을 사용하여 쉽게 측정할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 시냅스에서의 변화를 확인할 수 있습니다. PowerLab을 1.5V(즉, 0.75V 설정)로 연결하십시오.

  1. 멀티미터를 사용하여 제공된 회로의 각 저항기에 걸리는 전위차(PD)를 측정하십시오. 저항값을 기록하십시오. 특히 Rm3(시냅스 후 세포의 막)에 걸리는 전위차를 특별히 기록하십시오. 전압: ________________V
  2. Rs의 330 Ω 저항기를 330K Ω 저항기로 교체하십시오. Rm3에서의 전위차를 측정하십시오.
  3. 이제 Rs를 30K Ω으로 유지한 상태에서, Rm2의 30K Ω 저항기를 33K Ω 저항기로 교체하십시오. Rm3에 걸리는 전위차를 측정하십시오. 전압: ________________V
  4. 이제 Rs는 30K Ω, Rm2는 3K Ω으로 유지한 상태에서, R m1의 2K Ω 저항기를 20 Ω 저항기로 교체하십시오. Rm3에 걸리는 전위차를 측정하십시오. 전압: ________________V

연습 7
직-병렬 저항 네트워크의 예는 신경 또는 근육 섬유의 케이블 특성을 고려할 때 나타납니다. 섬유의 길이 상수는 막을 가로지르는 PD가 원래 값의 37%로 감소하는 거리입니다. 이러한 감쇄는 막 양측 유체의 내부 및 외부 저항이 (상대적으로 높은) 횡단 막 저항에 의해 션트되기 때문에 발생합니다. 저항값은 신경 세포 축삭을 따른 신호 전달을 제한합니다. 길이 상수는 지수 함수적 감쇄로 측정했을 때 1/e입니다. dE/dT=-E/RC; 여기서 E는 전압 차, R은 저항, C는 커패시턴스입니다. 또는 다른 형태로 E=Eoexp (-t/RC)로 나타낼 수 있으며, 여기서 Eo 는 시작 전압이고 t는 초 단위의 시간입니다. RC는 시정수인 타우(τ)라고도 합니다.

외부 유체의 저항이 세포 내 저항 및 막 저항에 비해 무시할 수 있다고 가정하면, 막의 수동적 저항 특성은 다음과 같은 회로 나타낼 수 있습니다.
길이 상수 계산을 위한 저항 네트워크 다이어그램; 전기 회로 내의 Rm 및 Ri 값을 보여줌.
저항 네트워크 도식; 전기 회로 분석의 길이 상수 계산을 위한 전압 프로브 설정.
저항기와 전선으로 구성된 브레드보드 회로, 기본적인 전기 회로 구성을 보여줌.
그림 7: 브레드보드 설정으로 구현된 네트워크 7.

Network 7의 A와 B 사이 한쪽 끝에 전압을 인가하십시오. 자극기를 사용하여 펄스 지속 시간 1초, 진폭 1V(0.5V로 설정), 주파수 0.75Hz를 선택하십시오. 각 "막" 저항기에 차례대로 전압계를 연결하고, 해당 저항기 양단의 전위차(PD)를 기록하십시오. 전압계 프로브의 한쪽 끝은 (A-리드, 적색)에 고정시킨 채, 다른 쪽 리드를 1~5번 위치로 순차적으로 이동시키십시오. 전원으로부터의 "거리"에 따른 전위차(PD)를 그래프로 그리십시오. 이때 막 저항기 사이의 거리는 단위 거리로 간주합니다. 작성한 그래프로부터 이 회로의 길이 상수를 결정하십시오. 전위차 대 거리 그래프; 전기장 분석, 물리학 개념, 전위차(V).
네트워크 7 길이 상수 그래프:______________

수초 형성 시 발생하는 것과 같은 횡단막 저항의 증가 또는 섬유 직경 증가와 관련된 섬유 내부 종단 저항의 감소가 미치는 영향은 길이 상수의 변화로 나타납니다. 저항값은 신경 축삭에서 실제로 발견되는 수치는 아니나, 거의 비례합니다. 마찬가지로, 모델의 "단위 거리"는 실제 신경 세포보다 상당히 확대된 규모입니다.

1.7) 정전 용량

축전기는 전하를 저장합니다. 저항을 통해 축전기에 전압이 인가되면 전류가 축전기로 흐르게 되며, 이때 축전기 양단의 전위차(PD)는 전원의 전위차를 향해 시간에 따라 기하급수적으로 증가합니다. 이러한 전압 변화의 시간적 과정은 인가된 전압, 정전용량 및 직렬 저항에 따라 달라집니다. 축전기가 방전될 때에는 이와 유사하지만 반전된 시간적 과정이 나타납니다.
10K Ω 저항기와 10μF 커패시터가 포함된 RC 회로도.
이 간단한 저항-커패시터(RC) 네트워크의 입력을 자극기의 A와 B에 연결하십시오. 1V(0.5V로 설정) 펄스를 1초의 지속 시간과 0.75Hz의 주파수로 사용하십시오. 또한, 데이터 수집 속도를 20 K/sec로 설정해야 합니다(패널 우측). PowerLab의 입력 클램프를 커패시터 양단에 연결하십시오. 수 초 동안 데이터를 수집한 후 정지하십시오. 확대(Zoom) 창을 사용하여 사각 펄스 중 하나의 상승 시간을 확대하십시오. 트레이스를 넓게 펴기 위해 확대 과정을 몇 번 반복해야 할 수도 있습니다. 기저선부터 전압 트레이스가 평탄해지는 지점까지의 상승 시간을 측정하십시오. 전위 변화의 시간 경과와 사각 펄스의 왜곡을 관찰하십시오. 다음을 변경했을 때의 효과를 관찰하십시오. 10μF ~ 중 하나의 커패시터 0.1 μF전압 측정 프로브를 저항기 양단에 연결하여 회로를 통해 흐르는 전류의 시간 경과를 관찰할 수 있습니다. 펄스를 몇 차례만 수집한 후 측정을 위해 정지하십시오. "M" 커서를 사용하여 상승 전의 기선(base line)으로 이동하고, 자유 커서(free cursor)를 사용하여 전압이 평탄해지기 시작하는 지점으로 이동하십시오.

마지막 예제는 저항성 성분과 정전 용량성 성분을 모두 포함합니다. 신경 및 근육 섬유의 수동 케이블 특성은 세포막 특성에서 비롯된 유사한 요소들에 의해 결정됩니다. 세포에는 횡단 막 저항뿐만 아니라 세포막의 전기적 특성으로 인한 막 정전 용량도 존재합니다. 이로 인해 전기적 전파 전위의 발달 시간 과정에 영향을 미치게 됩니다.

제공해주신 예시 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주시면, 요청하신 지침에 따라 전문적인 학술적 톤의 한국어로 정확하게 번역해 드리겠습니다.
길이 상수 계산을 위한 전기 회로도; 저항기, 커패시터, 네트워크 분석.
이 네트워크는 필요한 커패시터를 막 저항(Rm)에 병렬로 연결함으로써 네트워크 7로부터 구성할 수 있습니다.

실습 8.
네트워크 7에 10 μF 커패시터를 연결하십시오. A와 B에 연결된 자극기(stimulator)를 사용하여 1s, 1V (0.5 V 설정) 및 0.75Hz 펄스를 가하고, 각 막 저항(membrane resistor) 양단의 전위 변화를 관찰하십시오. "임계치" 전압(신경 세포에서 활동 전위가 생성되는 전압)을 0.2V라고 가정하고, 각 막 저항에서 전위가 임계치에 도달하는 데 걸리는 시간을 측정하십시오. 여기서 임계치란 살아있는 세포에서 활동 전위가 생성될 수 있는 전위 값을 의미합니다. 측정 결과를 '거리'에 따른 시간의 그래프로 그리십시오.

RLC 공진 실험을 위해 저항기와 커패시터를 포함하여 브레드보드 상에 구성한 전자 회로.
그림 8: 브레드보드 설정으로 구현된 네트워크 9.

시간 대 거리 차트; 축: 거리(단위 길이), 0.2 V에 도달하는 시간.
그림 8 그래프.

더 작은 0.1μF 커패시터로 교체하여 수초 두께 증가로 인해 발생하는 막 커패시턴스 감소 효과를 시뮬레이션하십시오. 선택한 저항기에서 임계값에 도달하는 시간의 변화를 관찰하십시오. 이 데이터를 더 큰 커패시터가 장착된 상태의 데이터와 동일한 그래프에 겹쳐서 표시하십시오.

근육막의 경우, T-세관(T-tubules)에 의해 막의 표면적이 증가함에 따라 커패시턴스가 증가하며, 이는 뉴런과 비교했을 때 더 큰 막 커패시턴스를 초래한다고 생각할 수 있습니다. 더 작은 커패시터는 무수신경 축삭에 수초(myelin)가 추가됨으로써 커패시턴스가 감소하는 현상을 설명하는 데 사용될 수 있습니다. 여기서 학습해야 할 핵심은 전기적 커패시턴스가 표면적에 비례하고, 커패시터의 "판" 또는 저장 표면을 분리하는 유전층(수초)의 두께와는 반비례한다는 점입니다.

모델 회로에서 제시된 특성들은 살아있는 표본에서 관찰됩니다. 그러나 세포들은 막을 통한 누설 및 축성 저항과 같은 특성에서 차이를 보입니다. 일부 세포들은 활동 전위를 생성하지 않습니다. 하지만 세포의 수동적 전기 특성은 수 밀리미터 거리에서 신호를 감쇄시키기 때문에, 수 밀리미터 이상의 거리를 통해 신호를 전달해야 할 때는 활동 전위가 생성됩니다. 다음 일련의 실험에서는 활동 전위의 기록 과정이 설명됩니다.

1.8) 학생들을 위한 질문

  1. 뉴런과 근육 세포의 길이 상수의 일반적인 값은 얼마입니까?
  2. 세포막 저항이 낮을 경우, 시정수(최종 값의 63%에 도달하는 시간)가 변하겠습니까? 만약 그렇다면, 세포막 저항이 낮아짐에 따라 어떻게 변하겠습니까? 시정수(tau)의 일반적인 수학적 공식은 무엇입니까?
  3. 오징어 거대 축삭과 같이 크기가 더 큰 축삭이 동일한 오징어 표본 내의 더 작은 축삭보다 전기 신호를 더 빠르게 전도할 수 있는 이유는 무엇입니까?

2. 신경 세포의 전도 특성

2.1) 브레드보드에서 살아있는 세포까지

회로 기판 실습에서 확인한 수동적 특성은 살아있는 세포에서도 측정 가능합니다. 하지만 신경 세포에서 이러한 수동적 특성은 활동 전위가 동반될 때 구분해 내기가 복잡할 수 있습니다. 뉴런의 능동적 특성은 휴지 막전위를 유지하고, 활동 전위를 생성하며, 이를 막의 길이를 따라 재생성하는 능력입니다.

신경삭을 따라 흐르는 전기적 흐름은 개별 뉴런 내에서, 그리고 한 뉴런에서 다음 뉴런으로 재생될 수 있습니다. 가재의 복측 신경삭(VNC)에서는 일부 뉴런들이 격막 접합부(즉, 간극 연접)를 통해 통신합니다. 이전의 브레드보드 실습에서 입증되었듯이, 저항을 변경하면 전기 신호의 전도를 방해할 수 있습니다. 이는 복측 신경삭 내의 간극 연접을 통한 전류 흐름을 변경하는 것과 유사합니다.

다음 일련의 실험에서는 VNC 내 복합 활동 전위의 전도 속도와 기타 특성을 조사합니다. 학생 실험 교육용으로 설계된 표준 장비를 사용하여 실험을 위한 VNC를 확보하는 방법과 반응을 유도하고 측정하는 방법을 시연하겠습니다.

2.2) 가재 표본 준비

가재의 복신경삭(vental nerve cord)이 본 실험에 가장 적합합니다. 이 신경은 해부가 용이하며, 전도에 영향을 주는 다양한 프로토콜을 본 표본에 적용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전, 아래의 가재 해부학 용어들을 숙지하시기 바랍니다.
갑각류 해부도; 표시된 부위: 두흉부, 복부, 부속지.
그림 9. 가재의 일반 해부도.
수정됨: http://www.enchantedlearning.com

2.3) 신경 전도에 관한 배경 지식

가재의 복측 신경삭은 꼬리 튀기 반응과 같은 회피 반응을 유발하는 신호를 전달하는 기능을 합니다. 본 실험에서는 손상되지 않은 전체 신경삭으로부터 기록을 수행합니다. 신경삭 내 각 뉴런의 개별 전위가 합쳐져 복합 활동 전위가 발생하며, 이는 기록 소프트웨어에 표시되는 측정 가능한 전기 펄스를 제공합니다. Erlanger, Gasser, Bishop(1924)는 복합 활동 전위를 기술한 선구자들입니다. 불응기의 특성, 전도 속도, 갭 결합 억제인 1-heptanol 또는 온도가 신경에 미치는 영향이 제시됩니다. 신경 세포 신호의 기본 원리를 학습하는 것은 전반적인 신경학적 기능에 대한 이해를 높이는 데 기여합니다(Bennett, et al., 191; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).

2.4) 재료

품목수량
대형 가재 (Procambarus clarkii)1
정밀 해부 가위1
포셉1
MLT016/X 신경 챔버1
Scope 소프트웨어가 설치된 노트북1
PowerLab1
PowerLab 증폭기1
PowerLab용 자극기 출력 케이블1
USB PowerLab/컴퓨터 커넥터1
흡입 전극이 포함된 매니퓰레이터 스탠드1
벌브가 포함된 유리 피펫1
가재 식염수가 담긴 비커1

2.5) 방법

2.5.1) 해부

가재를 해부하기 전에 신경 접시, 각종 기구 및 용액이 준비되었는지 확인하십시오.

  1. 가재를 잡기 위해 젖은 종이 타월로 감싸거나, 엄지와 검지 사이에 집게다리(chelipeds)가 오도록 하여 한 손으로 가재를 잡습니다.
  2. 다른 쪽 손을 사용하여 안와 사이의 부리 부분을 가위로 절개하십시오.
    가위를 이용한 가재 해부 과정, 해부학적 연구, 생물 교육.
  3. 절개 부위에서 아래쪽으로 잘라 머리가 완전히 분리되도록 합니다.
  4. 두흉부 기저부의 복부 위쪽을 절개하고 꼬리를 제거하십시오. (필요한 경우, 이 과정을 용이하게 하기 위해 집게다리와 보행각을 제거할 수 있습니다.)
    현미경 검사 설정이 포함된 해부학 실험실 실험에서 보여주는 곤충 해부 과정.
  5. 유영각을 제거하십시오.
    전갈 해부학 해부, 외골격 구조 중심, 집게발 및 마디형 신체 제시.
  6. 복부의 배쪽 양측을 따라 절개하십시오. 이때 심부 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
    곤충 해부; 유충 해부학 연구; 메스를 이용한 실험실 실험; 교육 연구.
  7. 복측 신경삭을 노출시키기 위해, 분리된 외골격 부분을 꼬리 부채의 기부까지 벗겨냅니다.
    무척추동물 해부 과정; 생물학 실험; 해부학 연구; 연구 방법.
  8. 포셉의 가장자리를 사용하여 복신경삭의 끝부분을 조심스럽게 제거하십시오. 이때 신경삭이 늘어나거나 으깨지지 않도록 주의하십시오. (신경삭에서 관찰되는 모든 결절은 가재의 신경절입니다.)
    정적 평형 상태의 유체역학, 미생물, 수중, 과학적 관찰, 도식.
  9. 신경 챔버의 금속 바 위에 신경삭을 펼쳐 놓으십시오. 복측 신경삭을 촉촉하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 신경 챔버에 가재 식염수를 금속 가로바 높이까지 충분히 추가하십시오. 그다음, 액체 표면이 바닥면의 금속 바에 겨우 닿을 정도가 되도록 가재 식염수를 피펫으로 뽑아내십시오.
    가재 식염수 (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2)2.2H2O; 2.45 MgCl22.6H2O; 5 HEPES, pH 7.4로 조정됨)
  10. 신경이 제자리에 배치되면, 두 개의 미니 훅 리드가 달린 자극기 케이블을 신경 챔버에 연결하십시오. 양극인 빨간색 리드를 신경삭 끝부분 근처의 외부 금속 루프 중 하나에 연결하고, 음극인 검은색 리드를 신경삭과 여전히 접촉해 있는 가장 가까운 인접 금속 루프에 연결하십시오.
    분광법 설정의 광학적 여기; 광자 분석; 방출 및 흡수 연구.
  11. 흡입 전극을 조작기 내의 신경 반대쪽 끝단 근처에 위치시키십시오.
  12. 복측 신경삭의 끝부분을 기록 전극 안으로 조심스럽게 흡입하십시오.

2.5.2) 기록

신경삭의 끝부분이 기록 전극 안으로 흡입되면, 전극이 프로브에 부착되어 있고 프로브가 충분히 접지되었는지 확인하십시오. 이는 접지 케이블을 파라데이 케이지(Faraday cage)에 단순히 연결함으로써 수행할 수 있습니다. 양극 및 음극 흡입 전극 전선 또한 프로브의 해당 위치에 연결해야 합니다. 프로브는 차동 증폭기에 연결되어야 하며, 이 증폭기는 다시 PowerLab에 연결됩니다.
패러데이 케이지, 현미경, 전극 및 증폭기 시스템을 갖춘 신경과학 실험 설정.

흡입 전극(suction electrode)의 전기 배선을 헤드 스테이지(head stage)에 연결하십시오. 배선은 상단 왼쪽에 빨간색(양극), 중앙에 녹색(접지), 하단에 검은색(음극)이 오도록 연결해야 합니다. 이는 아래 헤드 스테이지의 그림 10에 표시되어 있습니다. 접지선은 식염수 욕(saline bath)에 넣으십시오. 따라서 흡입 전극의 전선 하나는 + 입력단에, 다른 하나는 - 입력단에 연결합니다. 흡입 전극의 어느 전선이 + 또는 - 입력단으로 가는지 여부는 중요하지 않습니다.
전하 기호 도표; 양전하 및 음전하 표시, 녹색 표시등.
그림 10: 헤드 스테이지 입력단

증폭기의 설정은 다음과 같습니다:

대조군설정
하이 패스(High Pass)직류
노치 필터꺼짐
저역 통과 필터20kHz
용량 비교반시계 방향
DC 오프셋 미세 및 조동 노브반시계 방향
DC 오프셋 (+OFF)꺼짐
이득 조절 노브50
입력 (차동 모노 접지)분화
모드(STIM-GATE-REC)게이트(GATE)
Ω테스트꺼짐

제공된 USB 케이블을 PowerLab 뒷면과 컴퓨터 단자에 연결합니다. 컴퓨터 바탕화면에서 Scope 소프트웨어를 실행합니다. 화면 오른쪽 상단에서 "Channel 2"를 선택하고 끕니다. 화면 중앙의 바를 아래로 밀어 Channel 1만 표시되도록 화면을 조정합니다. 다음으로, 화면 오른쪽 상단에서 channel 1의 "Input Amplifier"를 클릭합니다. 다음 사항을 선택하십시오:

대조군설정
범위50 mV
교류확인됨
저역 통과꺼짐
단일 말단확인됨
반전확인됨

다음으로, 다시 "Set up" 항목에서 "Sampling"을 클릭합니다. 나타나는 화면의 "Sweep"이라는 제목의 상자에서 다음을 선택하십시오.

대조군설정
모드복수
샘플10회 스윕
제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주십시오.사용자
지연0초

마지막으로, "Set up" 탭에서 "Stimulator"를 선택하십시오. "Isolated Stim"을 끄기 위해 해당 상자를 클릭하십시오. 다음과 같이 설정을 선택하십시오:

대조군설정
모드다중의
지연5 ms
소요 시간1 ms
펄스(PULSE(S))2
간격15 ms
범위5 V
진폭0.5
  
  

우측 패널에서 "Time Base"를 확인하십시오. "Sample"을 1024로, "Time"을 20 msec로 변경하십시오.

전기생리학 그래프, 활동 전위, 전압 스파이크, 데이터 분석, 연구 결과
그림 1: Scope 소프트웨어로 기록한, 자극 간격이 15msec인 두 개의 복합 활동 전위.

실습 1.

화면 왼쪽 하단의 "Start" 버튼을 선택하십시오. 위의 설정대로라면, Scope 데이터 수집 창에 명확하게 정의된 복합 활동 전위가 나타나야 합니다(그림 1). 아래 그래프에 활동 전위의 일반적인 형태를 그리십시오(그림 12).
정적 평형 그래프, 전압 대 시간 차트로 밀리초 단위의 mV 변화를 표시함.
그림 12: 복합 활동 전위의 형태를 그리기 위한 빈 그래프.

화면 왼쪽 상단의 탭을 사용하여 전압을 천천히 낮춥니다. 그러면 활동 전위의 크기가 작아지다가 특유의 파형 또한 사라지게 됩니다. 전압을 낮추면 복합 활동 전위를 일으키기 위해 동원되는 뉴런의 수가 줄어듭니다. 일반적으로 더 큰 축삭이 낮은 전압에서 먼저 동원되며, 전도 속도가 더 빠르기 때문에 복합 활동 전위에서 먼저 나타나는 경향이 있습니다. 전압을 단계적으로 높여 반대 효과를 관찰하십시오. 더 많은 뉴런이 동원됨에 따라 복합 활동 전위 파형의 크기가 커집니다. 이 실습은 개별 뉴런마다 활동 전위 생성 임계값이 서로 다르다는 사실을 보여줍니다. 자극 전압을 높여도 복합 활동 전위가 더 이상 증가하지 않으면 모든 뉴런이 동원된 것이며, 이때 컴퓨터 화면의 활동 전위 파형에서 두 개의 뚜렷한 정점이 보여야 합니다.

실습 2.

뉴런 모집과 그 결과로 나타나는 복합 활동 전위를 살펴본 후, 불응기의 효과를 관찰하십시오. 이는 짧은 시간 간격으로 두 번의 자극을 주고 자극 간 간격을 변화시키면서, 두 번째 자극에 의해 유도된 복합 활동 전위의 진폭이 첫 번째 복합 활동 전위에 비해 감소하기 시작하는 자극 간 간격을 관찰함으로써 수행할 수 있습니다. 화면 왼쪽 상단의 탭을 사용하여 펄스 간 지연 시간을 변경하십시오. 두 번째 복합 활동 전위가 더 이상 유도되지 않을 때까지 지연 시간을 계속 단축하십시오. 두 번째 활동 전위가 더 이상 유도되지 않는 펄스 간 시간은 절대 불응기입니다. 절대 불응기가 끝난 시점부터 두 번째 자극이 최대 진폭의 활동 전위를 생성하게 되는 때까지의 시간을 상대 불응기라고 합니다. 제공된 빈칸에 절대 불응기와 상대 불응기의 추정치를 기입하십시오.
절대 불응기: ___________________
상대 불응기: ___________________

2.5.3) 전도 속도 측정

밀리미터 자를 사용하여 기록 전극에서 가장 가까운 자극 와이어와 기록 전극 사이의 거리를 측정하십시오. 기록된 트레이스(trace)로부터 복합 전위(compound potential) 내 이벤트의 다양한 피크까지의 시간을 측정하여 각 전기 신호의 전도 속도를 기록하십시오. 단위가 m/s가 되도록 mm 거리는 미터(m)로, msec 시간은 초(sec)로 변환하십시오.
1st 파형 전도 속도: __________________
2nd 파형 전도 속도: __________________
3rd 파형 전도 속도: __________________
4th 파형 전도 속도: __________________

2.5.4) 간극 연접 및/또는 전도 속도의 조절

다음으로, 신경 억제제의 특성을 조사합니다. 헵타놀(heptanol)의 디커플링 효과는 Johnston et al. (1980)에 의해 가재의 격벽 축삭(즉, 간극 연접)에서 처음으로 기술되었습니다. 전기적 통신과 관련된 이 효과는 곧 다양한 척추동물 및 무척추동물 시스템에서 확인되었습니다 (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). 이 복측 신경삭에서 전기적 통신의 역할을 이해하기 위해, 간극 연접을 디커플링시키는 (1mM) 1-heptanol 함유 식염수를 사용할 수 있습니다. 유리 피펫을 사용하여 헵타놀 용액으로 신경삭 전체를 세척하십시오. Scope 기록 소프트웨어에 기록되는 변화를 관찰하고 이를 요약하십시오. (파형의 변화 및 파형의 전도 속도 변화 여부를 확인하십시오). 또는 1-heptanol을 사용하는 대신, 배양액을 얼음처럼 차가운 식염수로 교체하여 파형이나 파형의 전도 속도에 나타나는 변화를 모니터링할 수 있습니다.

토론

온라인 비디오 프레 젠 테이션이 종이에 우리의 목표는 세포의 biophysical 속성, 부분, 전기 회로로 모델링 될 수있다는 것을 입증하는 것입니다. 또한, 비교적 쉽게 얻어진다 라이브 신경 조직과 전도 속도, 내화물 기간과 electrophysiological 레코딩 기술의 기본 원칙은 장비의 겸손한 투자 학부 학생 실험실 가능합니다. 주제와 제시 근본적인 패러다임은 쉽게 다른 과정의 요구 사항에 수정할 수 있습니다.

크레이 피쉬과 풍요의 유지 보수는 학생 중심의 실험을 위해 매력적인 모델을합니다. 갑각류 복부 신경 코드는 일반적으로 견고하고 3 시간 학생 실험실에 적합 시간 동안 최소한의 호수에 생리 무결성을 유지합니다.

왕새우 VNC에 큰 axons 중 일부는 표준 개구리 좌골 신경 준비에서 발견이 보여준 수있는 이상 갑 분기점, 그들의 기여에 대한 추가 실험이 실시 될 수 있으며, 서로 다른 특성을 통해 연결되어있다 감안할 때. 좌골 신경이 복합 행동 잠재력 및 전도 특성을 해결하기위한 전형적인 모델입니다. 그것도 재미있는 비교 전도 특성을 비교하는 학생들을위한 실험, 축삭 모집하고,이 두 사이에 내화물 준비 기간 수 있습니다.

공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이러한 실험 과정에서 사용되고 있습니다 실험실 매뉴얼, 토론토의 동물학, 대학의학과에서 박사 HL 앳우드에 의해 조율된에서 수정되었습니다. 연습도 사용하고 "기본 신경 과학 6 일 집중 IBRO 워크샵"에 제작되었다 1993 (쿠퍼 외., 1993)에 고려 대학교, 서울, 한국에서 개최되었다 설명서에서 수정되었습니다. 현재 수정은 다양한 대학에서 일 학생 감독 실험실을 제시 일반적인 장비를 사용해야했다. 켄터키 대학, 생물 학부, 학부 연구과 예술 & 과학 대학 사무실에서 지원됩니다.

재료

회로 기판

  1. 브레드 보드 실험은 아래에 나열된 전자는 같은 라디오 쉑으로 지역 전자 제품 가게에서 구할 수 있습니다.
  2. 빵 보드, 저항, 콘덴서, 배터리 및 실험에 명시된 바와 같이 브레드 보드에 대한 분기점이 될 수 있습니다 전선.
  3. 일반적인 전압계 (Wavetek Meterman 전압계)
  4. 컴퓨터에 라인 녹음에 대해서도 A / D 보드. 전기 신호는 PowerLab/4s 인터페이스 (ADInstruments, 콜로라도 스프링스, CO, 미국)에 온라인으로 기록됩니다. 우리는 차트 또는 범위 이름을 ADInstruments에서 표준 소프트웨어를 사용합니다.

생리학 실험

  1. 크레이 피쉬 (Procambarus clarkii). 아차 팔 라야 생물학 공급 주식 레이스 랜드, LA. 미국.
  2. 표준 크레이 피쉬 호수 : 반 Harreveld의 ​​솔루션 (1936)에서 수정. (MM)를 205 NaCl, 5.3 KCl, CaCl 2 13.5 2 시간 2 O, 2.45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES 및 산도 7.4로 조정. 모든 생리 화학 물질은 시그마 화학 회사 (세인트 루이스, MO)에서 얻은되었습니다.
  3. 해부 도구 : 좋아요 # 5 핀셋, 고급 가위, 나이프 블레이드 홀더, # 26002-20 곤충 핀 (모든 파인 과학 도구 (미국), 주식 회사, 373 - G 빈티지 파크 드라이브, 포스터 시티, CA 94404-1139에서 얻은)
  4. 신경을 가질 신경 챔버 요리 (ADInstruments, 콜로라도 스프링스, CO, 미국). 신경 챔버 요리와 함께 와이어는 신경을 자극하는 데 사용할 수 있습니다.
  5. 흡입 전극은 신호를 기록하는 데 사용됩니다.
  6. 속이는 사람 또는 링 스탠드에 클램프 또한 흡입 전극을위한 홀더 될 것입니다.
  7. 패러데이 케이지
  8. 해부 현미경
  9. 고강도 조명기 (광원)
  10. 현미경 플랫폼
  11. AC / DC 차동 증폭기 (AM 시스템 주식 회사 모델 3000)
  12. PowerLab 26T (AD 악기)
  13. 세포외 증폭기 (AD 악기)
  14. LabChart 7 (ADI 인 스트 루먼트)
  15. 해부 도구
  16. 반지는 서서 기록 흡입 전극의 소유자로서 봉사하는 클램프

참고문헌

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