방법 논문

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

DOI:

10.3791/2348

⸱

2011년 2월 2일

 , 
1Department of Biology and South Texas Center for Emerging Infectious Diseases, University of Texas at San Antonio - UTSA

이 논문에서

요약

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현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

초록

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감염, 외상, autoimmunity 또는 neurodegeneration 동안 중추 신경계 (CNS)를 침투 면역 세포의 분리는 종종 자신의 표현형 및 이펙터 기능을 정의해야합니다. Histochemical 접근 침투 세포의 위치를​​ 파악하고 병리 관련 CNS를 분석하는 수단입니다. 그러나, 원위치 histochemistry과 immunofluorescent 얼룩 기술은 특정 조직에 면역 세포 subtypes을 특성화하기 위해 한 번에 사용할 수있는 항체의 숫자에 의해 제한됩니다. 따라서, 유동세포계측법에 의해 면역 - phenotyping와 함께 histological 접근 방법이 완전히 지역 CNS의 침투의 조성을 특성화하기 위해 중요하다. 이 프로토콜은 discontinous percoll 그라디언트를 통해 CNS 세포 suspensions의 분리에 따라 달라집니다. 현재 문서는 효율적으로 효과적으로 유동세포계측법하여 하나의 샘플에서 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위해 활용할 수있는 두뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

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시약의 준비

칼슘없이 10X HBSS의 한 부분과 percoll 9 부분을 혼합하여 주식 isotonic percoll (SIP), 뇌 당 4 ML을 준비 + +와 MG + +.

없이 1X HBSS 70 %로 SIP를 준비 칼슘 + +와 MG + +, 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 적절 뇌의 당 2 ML.

참고 :이 percoll은 실온에서 사용해야하는 것이 좋습니다, 감기를 사용한 경우, 세포 클럼프하는 경향과 세포 분리 덜 효율적이다.

조직 수집 및 균질화

얼음처럼 차가운 1X HBSS과 좌심실을 통해 마우스 및 perfuse를 마취. 뇌 및 척수를 해부하다 모든 생쥐가 희생되기 전까지는 페놀 레드없는 RPMI으로 유지합니다.

7 15 ML 다운스 호모 지 나이저는 RPMI 3 ML을 포함에서 개최 조직은 부드럽게 추가로 조직을 떼어 놓다하는 타이 맞는 유봉 (B 크기) 다음 느슨한 맞는 유봉 (크기)와 세포 현탁액합니다. RPMI 7 개의 ML에 셀 suspensions의 볼륨을....

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토론

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정상 및 염증 마우스 조직에서 CNS의 leukocytes의 세포 표면 마커의 분석은 1-3 몇 수십 년 동안 이용되었다. 격리 프로토콜은 밀도 원심 분리에 의해 4 microglia 및 leukocytes의 분리에 근거하고 있습니다. 여기 불연속 percoll의 그라디언트를 사용하여 CNS의 leukocytes를 격리의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 세포의 분리 후, 각종 항체와 얼룩으로 - 이에 - CD45 이에 국한되지 않음, CD4, CD8, CD11b, CD19, 등 특정 병리의 유도에 따라 CNS에 침투해 면역 인구의 식별을 허용합니다. 안티 CD45 항체와 얼룩 것은 유동세포계측법하여 세 개의 서로 다른 인구를 보여, (1)의 연결을 세포, astrocytes와 다른 신경 세포 사이에 oligodendrocytes, 구성 CD45 부정적인 인구 (2) 대부분 surveillant microglial 세포 (3)를 포함 CD45 싸다, 또는 중간 CD.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 작품은 국립 다중 경화증 협회 (TA AEC에 3021 - A1 / T)와 산 안토니오 텍사스 대학에 의해 지원되었다.

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재료

조직 균질화 및 그라디언트

  • Percoll (아머샴)
  • 칼슘과 마그네슘없이 10X 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (Gibco)
  • 페놀 레드 않고 중간 RPMI 1640 (Gibco)
  • 7 - ML 15 - ML 다운스 조직 그라 인더스 (VWR)

유동세포계측법

  • 세포 스테 이닝 버퍼 (Biolegend)
  • 정화 랫 방지 마우스 CD16/CD32 (마우스 BD FC 블록), BD Pharmingen
  • Hemacytometer (피셔)
  • 안티 마우스 CD45 (복제 30 - F11), CD4 (클론 RM4 - 5), CD19 (클론 6D5), BioLegend
  • 10X 인산은 칼슘과 마그네슘없이 살린 버퍼 (써모 과학)
  • Paraformaldehyde (시그마 알드리치)
  • 유동세포계측법 분석 LSR II (BD Biosciences)와 수행

참고문헌

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  1. Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
  2. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.

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재인쇄 및 허가

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