Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

요약

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

초록

감염, 외상, autoimmunity 또는 neurodegeneration 동안 중추 신경계 (CNS)를 침투 면역 세포의 분리는 종종 자신의 표현형 및 이펙터 기능을 정의해야합니다. Histochemical 접근 침투 세포의 위치를​​ 파악하고 병리 관련 CNS를 분석하는 수단입니다. 그러나, 원위치 histochemistry과 immunofluorescent 얼룩 기술은 특정 조직에 면역 세포 subtypes을 특성화하기 위해 한 번에 사용할 수있는 항체의 숫자에 의해 제한됩니다. 따라서, 유동세포계측법에 의해 면역 - phenotyping와 함께 histological 접근 방법이 완전히 지역 CNS의 침투의 조성을 특성화하기 위해 중요하다. 이 프로토콜은 discontinous percoll 그라디언트를 통해 CNS 세포 suspensions의 분리에 따라 달라집니다. 현재 문서는 효율적으로 효과적으로 유동세포계측법하여 하나의 샘플에서 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위해 활용할 수있는 두뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

시약의 준비

칼슘없이 10X HBSS의 한 부분과 percoll 9 부분을 혼합하여 주식 isotonic percoll (SIP), 뇌 당 4 ML을 준비 + +와 MG + +.

없이 1X HBSS 70 %로 SIP를 준비 칼슘 + +와 MG + +, 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 적절 뇌의 당 2 ML.

참고 :이 percoll은 실온에서 사용해야하는 것이 좋습니다, 감기를 사용한 경우, 세포 클럼프하는 경향과 세포 분리 덜 효율적이다.

조직 수집 및 균질화

얼음처럼 차가운 1X HBSS과 좌심실을 통해 마우스 및 perfuse를 마취. 뇌 및 척수를 해부하다 모든 생쥐가 희생되기 전까지는 페놀 레드없는 RPMI으로 유지합니다.

7 15 ML 다운스 호모 지 나이저는 RPMI 3 ML을 포함에서 개최 조직은 부드럽게 추가로 조직을 떼어 놓다하는 타이 맞는 유봉 (B 크기) 다음 느슨한 맞는 유봉 (크기)와 세포 현탁액합니다. RPMI 7 개의 ML에 셀 suspensions의 볼륨을 작성합니다.

그라데이션이 설정

최종 30 % SIP를 만들기 위해 세포 현탁액에 SIP 3 ML 추가

천천히 계층 70 % SIP 위에 10 ML 세포 현탁액. 이 절차의 가장 중요한 단계이며, 70 % 혼합하여 30 % 솔루션을 피하고 중력 모드에서 설정 피펫 에이드를 사용합니다. 명확 평평한 라인은 70 % -30 %의 교차점에 표시되어야합니다.

500G 18 ° C.에서 30 분 원심 분리기 원심 분리기는 계면이 방해되지 않도록 최소한의 또는 전혀 브레이크와 함께 중지됩니다 있는지 확인하십시오.

전송 pipet을 사용하면 부드럽게 튜브의 상단에서 파편의 레이어를 제거하고 1X HBSS 8 ML을 포함한 깨끗한 원뿔 관에 70 % -30 %의 계면의 2.0-3.0 ML를 수집합니다. 계면을 포함하고있는 percoll 세 배에 대한 희석되었는지 확인, 18 500G에서 역전과 centrifugre 7 분으로 몇 번 혼합 ° C.

Resuspend 세포 얼룩 버퍼 1 ML의 펠렛 및 1.5 ML 튜브로 전송하고 4 만 G 1 분 ° C.에서 마이크로 원심 분리기를 사용하여 한 번 더 씻어

항체 염색법

antimouse CD16/CD32 투석을 50 μl의 Resuspend 알약은 FC 바인딩 사이트를 차단하는 세포 얼룩 버퍼에 1:200 희석. 10 분 얼음 위에 알을 품다. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.

30 분 얼음 항체 칵테일 믹스와 부화 50 μl를 추가합니다. 각 항체 먼저 최적의 희석을 평가하기 위해 titrated해야합니다. 레이저와 특정 흐름 cytometer의 필터 설정의 기능에 따라 선택한 해당 fluorochrome 조합을 사용합니다.

세포 얼룩 버퍼의 100-200 μl의 세포 얼룩 버퍼, resuspend 알약의 세포를 세척하고 cytometer에 즉시 분석하거나, 또는 세포는 4 PBS의 준비 2 % paraformaldehyde (PFA)에 resuspended 이상 박 저장할 수 있습니다 ° C .

대표 결과 :

그라디언트를 회전 후, 70 % -30 %의 계면은 정의된 흰색 후광이 있어야하고, 순진한 마우스에서 발견한 세포의 quantitation 마우스 당 3-5 X10 ⁵ 세포 (뇌 척수 플러스) 양보해야합니다. 염증 두뇌 CNS의 모욕 또는 질병 모델 (그림 1)에 따라 염증 세포의 숫자까지 할 수도 있습니다.

그림 1. 피크 질병에 순진하고 EAE - 머리에서 mononuclear 세포의 분리. 뇌 세포의 suspensions는 불연속 70% / 30 % percoll의 그라디언트를 통해 분리되었다. 세포 얼룩이 얼음에 30 분 안티 CD45 항체 뒤에 FC - 블록 incubated되었습니다. 세포는 세포 얼룩 버퍼에 씻어서하고, LSR - II에 2% PFA 전에 인수에서 수정되었습니다. CD45 강도는 세 개의 서로 다른 인구가 시각의 Y - 축 단위로 측정됩니다. CD45 ^안녕 침투 세포의 면역 표현형의 추가 특성이 추가 항체를 사용하여 구현하고 이후 유동세포계측법 의해 분석됩니다.

토론

정상 및 염증 마우스 조직에서 CNS의 leukocytes의 세포 표면 마커의 분석은 ^1-3 몇 수십 년 동안 이용되었다. 격리 프로토콜은 밀도 원심 분리에 의해 ⁴ microglia 및 leukocytes의 분리에 근거하고 있습니다. 여기 불연속 percoll의 그라디언트를 사용하여 CNS의 leukocytes를 격리의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 세포의 분리 후, 각종 항체와 얼룩으로 - 이에 - CD45 이에 국한되지 않음, CD4, CD8, CD11b, CD19, 등 특정 병리의 유도에 따라 CNS에 침투해 면역 인구의 식별을 허용합니다. 안티 CD45 항체와 얼룩 것은 유동세포계측법하여 세 개의 서로 다른 인구를 보여, (1)의 연결을 세포, astrocytes와 다른 신경 세포 사이에 oligodendrocytes, 구성 CD45 부정적인 인구 (2) 대부분 surveillant microglial 세포 (3)를 포함 CD45 ^싸다, 또는 중간 CD...

재료