Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수 있습니다 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포.
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방법 논문
옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발
이 논문에서
요약
초록
Plasmodium의 기생충, 말라리아의 원인이되는 대리인은 만 250 새로운 감염이 매년 발생하는 감염 아노 펠 레스 모기의 물린 통해 전송됩니다. 연구의 수십에도 불구하고, 말라리아에 대한 백신도 새로운 제어 전략의 필요성을 강조 아직 없습니다. 한 혁신적인 접근은 효과적으로 말라리아 기생충 전송을 제어하는 유전자 조작 모기를 사용하는 것입니다. 대상 돌연변이 유발을 통해 모기의 세포 신호 전달 경로의 고의적인 변경은, 기생충 개발 1 조절 발견되었습니다. 이러한 연구에서, 우리는 변화를위한 잠재적인 유전자 목표를 식별하기 시작할 수 있습니다. 타겟 돌연변이 유발은 전통적으로 대상 유전자와 대형 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의존하고 있습니다. 그러나, 안정적으로 변형 세포 라인의 생성 등 복잡한 DNA 분자의 건설 및 사용은 비용, 시간 소요 종종 비효율적이다. 따라서, 고정 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)을 사용하여 전략 episomal 및 염색체 DNA의 유전자 타겟 (2 검토)에 인공 단일 염기 대체를 소개하는 유용한 대안을 제공합니다. LNA - ON - 중재 대상으로 돌연변이 유발은 효모와 생쥐 3,4 모두 교양 세포에 대한 관심의 유전자에 변이 점을 소개하기 위해 사용되었습니다. 우리는 LNA 기능이 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포 모두에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현에 파란색 형광 단백질 (BFP) 표현에서 스위치로 이어지는 transfected episomal 대상에서 하나의 염기 변화를 소개하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시 . 이 변환은 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 효과가 LNA 기능에 의해 중재이 기술은 체외에서 생체내의 염색체 돌연변이 유발 타겟에 적용 될 수있는 제안이 될 수 있다고 처음으로 보여줍니다.
프로토콜
- 이전 프로토콜을 시작하기 위해서는 실험에 사용되는 모기 세포가 건강하고 ~ 80 %의 합류에서 자기편 경우 (그림 1). 것을 확인하는 것이 중요합니다 자란하거나 건강하지 못한 세포는 낮은 transfection 효율의 결과하고 일관성 결과를 줄 것이다.
- 30 분 28 ° C의 물을 욕조에 사용하기 전에 모든 미디어를 따뜻하게.
- 멤, 얼의 W / 글루타민 5 % 열 inactivated FCS, 0.2 % D - 글루코오스, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제,, 1 %가 아닌 - 필수 아미노산 : A. stephensi MSQ43 세포 E5 매체를 필요로합니다.
- 슈나이더의 Drosophila 중간 5 % 열 inactivated FCS,, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제 : A. gambiae SUA5B 전지는 S2 매체를 필요로
- 해동 얼음의 모든 transfection 시약 재료, plasmids, 그리고 oligonucleotides를 저장합니다.
- 모든 절차는 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.
- 자기편 세포 (A. gambiae SUA5B, A. st....
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토론
여기 A.로 LNA 기능의 transfection 다음 episomal 유전자 대상에서 단일 염기의 목표 전환에 대한 체외 방법 및 증거를 제공 stephensi 및 A. gambiae 세포. LNA - ON - 중재 유전자 변환은 사이트 특정 DNA 수리 대응의 유도가 필요합니다, 우리의 데이터는 모기 세포가 특정 사이트 돌연변이 유발이 메커니즘을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 방법 여기서 제시가 episomal 대상의 변환에 기반하지만, 우리의 데이터는 다른 시스템에서 왔습니다으로 LNA - ON - 중재 전환이 모기 세포의 염색체 목표에 대해 최적화할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 유전자 변환 따라서 복잡한 프로토콜 및 장기 약물 선택 정권없이 안정적으로 변형 모기 세포 라인의 생성을 촉진합니다. 또한, 기존 기술의 사용에 따라 mRNA 특정 살 세포에 형광 태그가 5-7 생물 학적 연구에 대한 변환 염색체 유전자의 목표.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 유동세포계측법 그녀 도움 캘리포니아 국립 메이트 연구 센터에서 애비 스피너 감사하고 싶습니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 보건 국립 연구소 (NIH) AI073745, AI080799 및 AI078183의 기금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Effectene transfection 시약 | Qiagen | 301425 | |
| GFP 대조 플라스미드 (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP 플라스미드 (pcDNA5/FRT/TO) | Concordet 박사의 기증품3 | ||
| LNA-ONs | Concordet 박사의 기증품3 | ||
| MEM, Earle’글루타민 함유 s | Invitrogen | 11095 | |
| 우태아혈청 (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| 슈나이더’s <전자현미경>초파리 배지 | Invitrogen | 11730 | |
| 비필수 아미노산 | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-글루코스 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 항생제 | Invitrogen | 15140 | |
| 6-웰 배양 플레이트 | Corning | 3516 |
참고문헌
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
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재인쇄 및 허가
