유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

요약

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

빛이 망막 ¹ 매를과 원추형 photoreceptors을 자극하면 척추 비전의 첫 번째 단계는 이루어집니다. 이 정보는 다음 ON과 OFF 경로로 알려져 있습니다 무엇으로 차별되어 있는데. 빛의 강도 증가 (BCS에서) 또는 감소 (BCS 오프)에 대한 응답으로 depolarize 바이폴라 세포에 photoreceptors 신호 조명 정보 (BCS). 빛의 정보를이 분리들은 오프 BCS 직접 흥분성의 입력을받을 내부 plexiform 층 (IPL), 중 끄기 sublamina에 stratifying dendrites이있는 망막 신경절 세포 (RGCs)의 수준에서 유지 또는 stratifying입니다 그들은 BCS에 직접 흥분성의 입력을받을 IPL의에 sublamina. 조명 (온과 경로 끄기)의 증가 또는 감소에 대한 정보는 이러한 분리는 병렬로 보존하고 뇌에 신호입니다.

RGCs은 망막의 출력 세포이며, 따라서 빛의 정보가 두뇌에 시각 핵으로 신호를 얼마나 이해하기 위해 연구하는 중요한 세포입니다. 최근 년간 마우스 유전학의 진보는 특정 RGC 인구가 electrophysiological 녹음 대상 RGC subtypes ^{2 3 4} 특정의 식별이 가능하도록하기 위해서 형광 단백질로 분류 아르 형광 기자 마우스 라인의 다양한 결과있다. 여기, 우리는 그대로 고립되어 망막 준비에 찬란 표시 신경절 세포에서 빛을 응답을 기록하는 방법을 제시. 이 고립된 망막 준비 돌기 아버가 온전하고 전체 RGC 돌기의 아버 전체의 입력이 보존됩니다 RGCs에서 레코딩을 허용합니다. 이 방법은 신경절 세포 subtypes 다양한 걸쳐 적용되며 단일 세포 생리학 기법의 다양한 의무가 있습니다.

프로토콜

동물 사용 정책 : 동물 미네소타 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 프로토콜을 사용하여, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서에 설명된 지침에 따라 치료를 받았다.

솔루션 1) 준비

1. electrophysiological 녹화를 수행하기 전에, 세포 세포와 효소 솔루션 대비해야합니다.
2. 세포외 솔루션 : H ₂ O 1 L 앤드 중탄산 1.9 g (23 ㎜)과 가루 에임스 '매체의 혼합 한 병 (8.8g) (시그마). 모든 지점에서 세포외 솔루션 95% O _{5분의 2} %의 CO ₂ 가스 혼합물로 포화 수 있습니다. 망막 스토리지 비커 200 ML을 전송합니다. 망막가 탑재되면 중력 재관류에 대한 재관류 시스템 컨테이너에 남아있는 솔루션을 놓으십시오.
3. 세포내 솔루션 : 세포 솔루션은 이전에 만들어진 후 aliquoted 500-1000 μL aliquots로하고 -20 ° C.에 저장된 있었어야했는데 125 K - 글루 콘 산, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 나 ₂ ATP....

토론

이 기술은 격리된 망막 망막 신경절로부터 세포 레코딩에 적용됩니다. 비록 위에서 사용된 마우스 라인에서 본질적으로 감광성의, melanopsin - 표현 RGCs 것은 EGFP ^{2, 5} 표시되며,이 프로토콜은 다른 찬란 표시 RGC 라인 즉시 양도하거나뿐만 아니라 무작위로 선택된 RGCs에서 레코드에 일반 수 있습니다. 각 RGC 및 각 입력 뉴런의 돌기 아버가 전적으로 그대로 유지되기 때문에이 기술은 특히 중요합니다. 녹음은, 쉽게 전류 또는 전압 클램프 모드, 구성 세포에 연결된 또는 느슨한 - 패치에 수행할 수 있습니다, 심지어 nucleated 패치에 사용할 수있는 내부 또는 망막 신경절 세포 점막에서 외부 출력 패치 구성. 이 기술은 쉽게 망막이 항상 녹화하기 전에 RGC 식별 빛에 노출되어야합니다 신경절 세포를 집중하기 위해 더욱 찬란 분류 있질 amacrine 세포 ⁷ 비 있질 amacrine 세포에서 형광의 활용 ⁸ 하나는 한계를 기록 적응 수 . 외인성.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ames’ 배지	Sigma-Aldrich	A1420
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
탄산수소나트륨	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hydrazyde	Invitrogen	A10442
Neurobiotin	Vector Laboratories	SP1120
전극	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
포셉	Fine Science Tools	11252-30
안과용 가위	Fine Science Tools	15000-00
Streptavidin 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
염소 혈청	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210