유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

요약

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

빛이 망막 ¹ 매를과 원추형 photoreceptors을 자극하면 척추 비전의 첫 번째 단계는 이루어집니다. 이 정보는 다음 ON과 OFF 경로로 알려져 있습니다 무엇으로 차별되어 있는데. 빛의 강도 증가 (BCS에서) 또는 감소 (BCS 오프)에 대한 응답으로 depolarize 바이폴라 세포에 photoreceptors 신호 조명 정보 (BCS). 빛의 정보를이 분리들은 오프 BCS 직접 흥분성의 입력을받을 내부 plexiform 층 (IPL), 중 끄기 sublamina에 stratifying dendrites이있는 망막 신경절 세포 (RGCs)의 수준에서 유지 또는 stratifying입니다 그들은 BCS에 직접 흥분성의 입력을받을 IPL의에 sublamina. 조명 (온과 경로 끄기)의 증가 또는 감소에 대한 정보는 이러한 분리는 병렬로 보존하고 뇌에 신호입니다.

RGCs은 망막의 출력 세포이며, 따라서 빛의 정보가 두뇌에 시각 핵으로 신호를 얼마나 이해하기 위해 연구하는 중요한 세포입니다. 최근 년간 마우스 유전학의 진보는 특정 RGC 인구가 electrophysiological 녹음 대상 RGC subtypes ^{2 3 4} 특정의 식별이 가능하도록하기 위해서 형광 단백질로 분류 아르 형광 기자 마우스 라인의 다양한 결과있다. 여기, 우리는 그대로 고립되어 망막 준비에 찬란 표시 신경절 세포에서 빛을 응답을 기록하는 방법을 제시. 이 고립된 망막 준비 돌기 아버가 온전하고 전체 RGC 돌기의 아버 전체의 입력이 보존됩니다 RGCs에서 레코딩을 허용합니다. 이 방법은 신경절 세포 subtypes 다양한 걸쳐 적용되며 단일 세포 생리학 기법의 다양한 의무가 있습니다.

프로토콜

동물 사용 정책 : 동물 미네소타 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 프로토콜을 사용하여, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서에 설명된 지침에 따라 치료를 받았다.

솔루션 1) 준비

1. electrophysiological 녹화를 수행하기 전에, 세포 세포와 효소 솔루션 대비해야합니다.
2. 세포외 솔루션 : H ₂ O 1 L 앤드 중탄산 1.9 g (23 ㎜)과 가루 에임스 '매체의 혼합 한 병 (8.8g) (시그마). 모든 지점에서 세포외 솔루션 95% O _{5분의 2} %의 CO ₂ 가스 혼합물로 포화 수 있습니다. 망막 스토리지 비커 200 ML을 전송합니다. 망막가 탑재되면 중력 재관류에 대한 재관류 시스템 컨테이너에 남아있는 솔루션을 놓으십시오.
3. 세포내 솔루션 : 세포 솔루션은 이전에 만들어진 후 aliquoted 500-1000 μL aliquots로하고 -20 ° C.에 저장된 있었어야했는데 125 K - 글루 콘 산, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 나 ₂ ATP, 0.5 MM NaGTP : 세포 솔루션은 우리가 사용하는 현재 표시된 전류 클램프 레코딩 (MM)를 위해 필요한 실험에 따라 달라집니다 코 ⁵ 7.2 산도. 같은 10 μm의 Alexafluor - 594 히드라 지드 (Invitrogen)로 형광 추적기는 실험, 그리고 neurobiotin (0.3 %) 중 dendrites을 시각화에 추가할 수있는 것은 또한 촬영 다음 세포 해부학 분석을 위해 포함될 수 있습니다. 언제 녹음 준비, 세포 솔루션을 녹여.
4. 효소 용액 : 세포 솔루션의 ML 4.150에 83 MG의 Hyaluronidase (워싱턴 화학 물질)로 10,000 유닛 Collagenase를 (워싱턴 화학) 결합합니다. -20 ° C. 50 μL aliquots에 저장 Aliquots은 몇 주 동안 사용할 수 있습니다. 때 망막을 치료하는 준비 부풀어 오른 세포외 용액 500 μL로 나누어지는를 희석.
5. 인산은 솔루션 (PBS)를 버퍼 : H ₂ O 800 ML에서 NaCl의 8g, KCl의 0.2 g, 나 ₂ HPO ₄ 1.4 g와 KH ₂ PO ₄ 0.24 _g을 추가합니다. NaOH로 pH를 7.4로 가져와. 1 L.로 볼륨을 조정
6. 0.2 M 인산 버퍼 : H ₂ O 800 ML에서 나 ₂ HPO ₄ 21.8 g과 아니 ₂ PO ₄ 6.4 g을 추가합니다. 1 L.에 볼륨을 가지고
7. 4 % Paraformaldehyde 솔루션 : 열 60 50ml H ₂ O ° C. , 4g의 paraformaldehyde를 추가합니다 몇 분 동안 저어. 1M NaOH의 몇 방울을 (5 방울) 추가, 솔루션은 분명 때까지 저어 유지. 비커에 50 ML 0.2 M 인산 버퍼를 추가합니다. 산도 스트립을 (~ 7.4)를 사용하여 산도를 확인합니다. 필터와 냉각.
8. 차단 솔루션 (10 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100가) : PBS의 1.8 ML에서 염소 혈청 10 μL 트리톤 X - 100 0.2 ML를 추가합니다. TritonX - 100은 조직을 permeabilise을 제공합니다.
9. Streptavidin 솔루션 (5 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100, 1:500 Streptavidin 594) : PBS의 1.9 ML에서 염소 혈청 0.1 ML 10 μL 트리톤 X - 100 Streptavidin 594 4 μL를 추가합니다.

마우스 망막 2) 분리

필요한 해부 도구 : 1 # 2 포셉, 2 # 5 포셉, ophthalmologic 가위

1. 이 경우, 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사는 부드럽게 눈 뒤에 직각 # 2 포셉를 삽입하고 눈알을 리프팅로 ₂ 질식과 명백히하다의 안구 CO.
2. 세포외 솔루션 35mm 페트리 접시에 안구를 놓습니다. 시신경 및 ophthalmologic 가위를 사용하는 연결된 extraocular 근육이나 결합 조직을 잘라. ophthalmologic 가위로 각막 버려야하고 # 5 포셉를 사용하여 렌즈를 빼낸다. # 5 포셉 한 켤레를 사용하여 공막엔 테어와 망막과 공막엔가 광학 디스크에서 만나 시신경을 도려 포셉을 사용합니다. 부드럽게 멀리 세안 컵에서 망막 껍질. 팁 : 시간을 최소화하기 위해 다음 단계로 이동하기 전에 두 망막의 각 단계를 수행합니다.
3. 망막에 부착된 유리를 제거하는 집게를 사용하십시오. 이것은 집게와 망막 위에 투명 유리 "를 잡아"에 의해 수행할 수 있습니다. 유리체는 성공적으로 제거한 경우, 포셉에 대한 명확하고 젤라틴 물질로 표시되어야합니다. 팁 : 유리체의 절반 아래의 제거에 망막을 칼자국 것은 가능한 조직의 양을 극대화하고 쉽게 챔버에 장착하게됩니다.
4. 그들이 소화 준비되기 전까지는 최소한의 주변 조명과 어두운 환경에서 상온에서 산소를 세포 솔루션 망막 보관하십시오. 망막은 ~ 6 시​​간 동안 이러한 방식으로 저장할 수 있습니다.

3) 효소 혼합과 망막의 처리 및 기록 챔버에 장착

1. 35mm 페트리 접시에 500 μL 세포 솔루션, 장소 솔루션 collagenase / hyaluronidase의 나누어지는을 희석하여 망막을 전송하기만하면됩니다.
2. 망막은 -이 포함되어 유지부드러운 교반과 함께 15 분에 대해 95 % O2 / 5 % CO ₂ 환경에서 주입 페트리 접시, 커버와 어둠 속에서. 이 단계는 남아있는 유리를 소화에 에이즈와 신경절 세포 레이어에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 팁 : 더 적은 유리 또는 불리한 영향을 관찰하는 경우 어린 동물에서 망막에 대해, 시간이 ~ 5 분 정도 단축하실 수 있습니다.
3. 효소 함유 매체에서 망막을 제거하고 세포 솔루션에 광범위하게 세척
4. 아래로 향하게 photoreceptor 레이어와 챔버 ⁶ 녹음에 망막을 전송합니다. 피펫 또는 조직 중 하나와 함께 남아있는 액체를 멀리 윅 특히 신경절 세포 계층과 접촉을 피하 망막만을 가장자리를 만지지 않도록주의하는 조직을 버리고 망막의 측면을 롤. 조직 앵커 즉시 세포 솔루션으로 챔버를 채우기 위해 망막 이상의 나일론 메쉬와 플래티넘 반지를 놓습니다.
5. , 현미경 단계에 기록 챔버 마운트 중력 재관류와 진공 흡입을위한 튜브를 연결하고 접지 와이어를 연결합니다.

4) EGFP 표현 신경절 세포의 현지화 가벼운 자극

1. 1 ML / 분 또는 더 빠른 속도로 세포 솔루션으로 중력에 의해 망막을 Perfuse. 팁 : 재관류 속도가 너무 느린 경우, 조직은 충분히 산소와 시냅스 신호가 중단될 수 있습니다되지 않습니다.
2. 세포내 솔루션으로 녹음 피펫을 기입하여 피펫 홀더에 삽입. 팁 : 3 5MΩ의 범위에서 resistances와 Pipettes이 최상의 결과를 제공합니다.
3. 레코딩 피펫을 집중하기 위해 낮은 배율 (10X 목표, NA 0.3)에서 적외선 차등 간섭 대비 (DIC) 광학에서 망막을 시각화. 적외선은 가시 광선이 망막에 노출을 최소화하고 가벼운 적응을 최소화하는 데 사용됩니다. 높은 배율 (40X 목표, NA 0.8)로 이동하고 단지 조직 위의보기에 전극을 가지고.
4. 높은 배율 (40X 목적)에서 epifluorescence (EGFP에 대한 480 nm의)와 망막을 조명하고 테이프 (그림 1A)를 사용하여 컴퓨터 모니터에 형광 신경절 세포와 마크를 선택합니다.
5. DIC와 적외선 조명에서 대상 신경절 세포 (그림 1A) 근처에 기록 전극을 위치. 청정 지역은 즉시 폴리에틸렌 튜브와 피펫 홀더에 연결된 12cc 플라스틱 주사기를 통해 기록 전극에 부드러운 긍정적인 압력을 적용하여 세포를 덮고. 앰프에 어떤 전압 오프셋을 제로. 플레이스 전극 선택한 신경절 세포에 보조개가 세포 표면에 나타날 때까지.
6. 전압 클램프 모드에서 앰프로 테스트 펄스를 적용하고 피펫을 통해 현재의 통과를 모니터링합니다. 전극과 세포 사이에 도장을 만드는 부정적인 압력을 적용합니다. 세포 현재는 세포의 막이과 피펫 사이 GΩ 전기 인감을 나타내는 것입니다 개최 때까지 봉인하고 기다리는 시작하면 부정적인 압력을 릴리스합니다. 용량성 과도가 나타나지 그리고 압력의 모든 응용 프로그램을 릴리스하기 전까지 부정적인 압력을 부드럽게 펄스를 적용합니다. 도움말 : 액세스 (시리즈) 저항 (> 30MΩ) 높으면, 이것은 종종 부정적인 압력을 추가, 아주 부드러운, 펄스에 의해 ameliorated 수 있습니다.
7. 일단 안정적인 도장은 부정적인 압력의 펄스를 적용 도달했습니다. 전체 셀 모드가 얻은 후에, 세포는 어두운 5 분 적응할 수 있습니다. 기록, 전체 필드, 흰색 가벼운 자극 (그림 1B)로 현재 클램프 모드, 응답 인치
8. 기록에 따라, Alexafluor - 594은 dendrites으로 확산됩니다. 추적기는 594 nm의에서 epifluorescence에 따라 시각하고 신경절 세포가 여부에 -, epifluorescence 및 DIC 적외선 광학 ⁵ 사이의 전환에 의해 오프, 또는 이중 층상. 결정하기 위해 사용할 수
9. neurobiotin가 피펫과 망막은 immunohistochemistry에 대한 처리 될 수 있습니다에 포함되어있다면, 피펫은 부드럽게 막의 최소한의 중단을 제공하기 위해 철회해야합니다.

기록 신경절 세포의 해부학 5) 분석

neurobiotin로 작성하면 다음과 같은 기록 신경절 세포의 형태학의 자세한 분석을 위해 수 있습니다. 팁 : 기록 신경절 세포와 세부 형태 사이의 구체적인 상관 관계가 필요한 경우, 그것이 준비 당 하나의 RGC를 기록하고 작성하는 것이 가장 수 있습니다.

1. neurobiotin은 세포내 솔루션에 포함되어 있었다면 다음 paraformaldehyde 용액에 망막을 배치하고 4 박 수정 ° C.
2. , PBS에서 최소한 6 변경 사항을 최소한 2 시간 린스. 차단 솔루션을 포함하는 접시에 망막을 전송합니다. 쉐이크에 2 시간 실내 온도를 솔루션을 차단에 둡니다.
3. Streptavidin 솔루션으로 차단 솔루션을 교체합니다. 4 이일 ° 뿌리에서 C를 품어. PBS에서 망막 6 rinses, 20 분 각각 린스.
4. 유리 슬라이드에 Vectashield와 망막를 탑재합니다.망막은 신경절 세포와 배치해야합니다. 공촛점 현미경 (그림 1C)을 수행합니다.

대표 결과

망막 건강하고 절개가 성공했다면, 개별 신경절 세포는 높은 배율 (그림 1A)에서 DIC 아래에 표시해야합니다. 건강에 해로운 망막은 큰 과립 핵을하고 폐기해야합니다. 주어진 신경절 세포의 시냅스 반응이 그대로있다면, 세포는 본질적으로 - 감광성의 신경절 세포 (그림 1B), 지속적인 탈분극의 경우, 가벼운 증상에 반응 또는 행동 잠재력과 오프셋과해야합니다.

그림 1. 현지화, 녹음, 그리고 찬란 표시 망막 신경절 세포의 얼룩이. (A) GFP 긍정적인 RGC는 40X 배율 (왼쪽 패널)와 DIC 조명 (오른쪽 패널)에서 epifluorescent 조명 아래에서 시각. 찬란 분류 RGC에서 전체 셀 전류 클램프 모드에서 기록된 M2 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포의 (B) 시냅틱 라이트 반응. (C) 전체 셀 녹음 대상 epifluorescence 아래에서 확인되었다 M1 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포는 neurobiotin 가득 다음 immunohistochemistry에 대한 처리.

토론

이 기술은 격리된 망막 망막 신경절로부터 세포 레코딩에 적용됩니다. 비록 위에서 사용된 마우스 라인에서 본질적으로 감광성의, melanopsin - 표현 RGCs 것은 EGFP ^{2, 5} 표시되며,이 프로토콜은 다른 찬란 표시 RGC 라인 즉시 양도하거나뿐만 아니라 무작위로 선택된 RGCs에서 레코드에 일반 수 있습니다. 각 RGC 및 각 입력 뉴런의 돌기 아버가 전적으로 그대로 유지되기 때문에이 기술은 특히 중요합니다. 녹음은, 쉽게 전류 또는 전압 클램프 모드, 구성 세포에 연결된 또는 느슨한 - 패치에 수행할 수 있습니다, 심지어 nucleated 패치에 사용할 수있는 내부 또는 망막 신경절 세포 점막에서 외부 출력 패치 구성. 이 기술은 쉽게 망막이 항상 녹화하기 전에 RGC 식별 빛에 노출되어야합니다 신경절 세포를 집중하기 위해 더욱 찬란 분류 있질 amacrine 세포 ⁷ 비 있질 amacrine 세포에서 형광의 활용 ⁸ 하나는 한계를 기록 적응 수 . 외인성...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ames’ 배지	Sigma-Aldrich	A1420
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
탄산수소나트륨	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hydrazyde	Invitrogen	A10442
Neurobiotin	Vector Laboratories	SP1120
전극	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
포셉	Fine Science Tools	11252-30
안과용 가위	Fine Science Tools	15000-00
Streptavidin 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
염소 혈청	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210