깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

초록

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사용 미세 주입 주사기 및 미세 인젝터 준비:
   1. 각 기밀 미세 주입 주사기를 미세 주입 펌프의 랙에 잠급니다.
   2. 밀폐 주사기의 끝을 작은 계량 보트에 들어 있는 멸균수에 넣고 플런저를 부드럽게 펄럭여 내부 와이어에 윤활유를 발라줍니다. 플런저를 펌프의 백스톱까지 고르게 당겨 물을 채웁니다.
   3. 마이크로인젝터에 연결된 PE20 튜브를 멸균수로 채워진 26ml 주사기에 부착된 1G(갈색 허브) 바늘에 밀어 넣습니다. 마이크로인젝터를 통해 멸균수를 분사하고 스프레이 패턴과 거리를 검사합니다.
      알림: 물은 마이크로인젝터 팁에서 매우 멀리 똑바로 분사되어야 합니다. 스트림이 직선이 아니면 사출 위치가 올바르지 않습니다.
   4. 멸균된 마이크로인젝터를 멸균 필드에 놓습니다.
   5. 바늘에서 튜브를 밀어내고 마이크로인젝터 튜브를 똑바로 세워 물이 떨어지는 것을 방지하는 동시에 바늘에 의해 손상된 부위 아래의 튜브를 절단합니다.
   6. 마이크로 인젝션 주사기 플런저를 약간 앞으로 밀어 바늘 끝에 물방울을 만들고 물이 채워진 PE20 튜브(마이크로인젝터에 연결됨)를 바늘 위로 밀어 넣습니다.
      알림: 이렇게 하면 마이크로인젝터 끝에 형성될 수 있는 막힘을 제거할 수 있는 적절한 배압을 허용하는 액체 대 액체 연결이 생성됩니다.
   7. 플런저를 완전히 앞으로 밀어 시료 로딩을 준비하고 마이크로인젝터에 미량 에탄올이 남아 있지 않은지 확인합니다.
   8. 마이크로인젝터 끝에 형성된 물방울을 깨끗한 실험실 닦기에 여러 번 만져 누출 설정을 확인하십시오.
2. 알림: 실험실 물티슈를 만질 때 젖은 부분이 하나만 형성되어야 합니다. 방울이 더 많으면 시스템에 누출이 있는 것입니다.
3. PE20 튜브를 연결부에서 제거할 때마다 강력 접착제 도포를 제어하고 날카로운 가위나 면도날로 PE20 튜브를 다듬어 누출을 방지하십시오.
4. 주사기 플런저를 0.2μl 뒤로 당깁니다. PE20 튜브/마이크로인젝터의 멸균수와 주입할 용액 사이에 기포를 만듭니다.
5. 참고: 이 기포는 주입액의 희석, 물의 오염을 방지하고 주입 중에 움직이기 때문에 주입 과정을 모니터링할 수 있습니다. 하나의 단단한 기포가 생성되어야 합니다.
6. 마이크로인젝터를 주입할 시약에 넣고 주사기 플런저를 백스톱까지 천천히 당깁니다.
7. 주사를 위한 동물 준비:
8. 쥐의 가슴을 실험자의 가슴에 대십시오. 70% 에탄올(v/v)에 적신 면 어플리케이터로 캐뉼라 주변을 청소합니다.
9. 알림: 적절하게 다루면 쥐를 컵에 넣은 손으로 부드럽게 제지할 수 있습니다. 그렇지 않으면 목덜미가 필요할 수 있습니다.
10. 작은 집게를 사용하여 폐쇄기를 제거하고 70% 에탄올(v/v)이 포함된 계량 보트에 넣습니다.
11. 주사 수행:
12. 채워진 마이크로인젝터를 캐뉼라에 넣습니다. 미세 주입 펌프에서 시작을 누르고 기포 움직임을 모니터링합니다.
13. 알림: 마이크로인젝터가 들어 오르지 않도록 가벼운 압력을 가해야 할 수도 있습니다. 기포는 균일하게 전진하여 마이크로인젝터에 완전히 들어가야 합니다.
14. 주입이 완료되고 주사 후 확산 기간이 지나면 캐뉼라에서 마이크로인젝터를 제거하고 폐쇄기를 교체합니다.
15. 참고: 일반적인 주입 후 확산 시간은 약리학적 시약의 경우 2 – 4분, 바이러스의 경우 2 – 10분입니다. 주입 후 기간 동안 마이크로인젝터를 그대로 두면 주사액이 조직으로 확산되지 않고 캐뉼라를 통해 역류하는 것을 방지할 수 있습니다. 에탄올로 채워진 계량 보트 측면에 폐쇄기를 배치하여 캐뉼라에 다시 삽입하기 전에 에탄올이 배출

되도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
캐뉼라 튜빙	아마존 공급/소형 부품	HTXX-26T-60	26 게이지, 하이포튜브 S/S 316-TW 26GA
폐쇄기	아마존 공급/소형 부품	GWXX-0080-30-05	33 게이지, 와이어 S/S 316LVM 0.008 IN
마이크로인젝터 와이어	MicroGroup	33RW 304	33 게이지
슈퍼 글루	록타이트	3924AC	액체, 비젤, 고압멸균 가능
마이크로인젝터 플라스틱 튜브	Becton Dickson	427406	PE20
중간 중량 지혈제	World Precision Instruments	501241-G
눈금자	피셔	09-016	150mm
겸자	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
로터리 공구	Dremmel	285	2단
컷오프 디스크	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
미세 주입 펌프	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul 유리 주사기	Hamilton	7001KH	바늘 스타일: 25s/2.75"/3
코튼 팁 어플리케이터	피셔	23-400-101
실험실 물티슈	Kimwipes	34133
조작 소프트웨어	Coulbourn	그래픽 상태
조작 챔버	Coulborun	Habitest