줄기 세포 유래 신경 전구 세포를 인간 피질 절편으로 이식

초록

출처: Palma-Tortosa, S., et.al. 인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서 성인 인간 피질의 기관형 배양. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 줄기 세포 유래 신경 전구 세포를 인간 피질 조직 절편으로 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 기저막 기질에서 전구 세포를 분리하고 재현탁한 다음 트랜스웰 어셈블리에 배치된 피질 절편에 주입하는 작업이 포함됩니다. 기질 응고 및 신경 분화를 허용하기 위해 배양한 후 이식된 조직은 추가 분석을 위해 준비됩니다.

프로토콜

샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. lt-NES 세포의 증식 및 분화

참고: 인간 유도만능줄기세포 유래 장기 자가 재생 신경상피유사 줄기(lt-NES) 세포를 생성하고 구성 프로모터(GFP-lt-NES 세포) 아래에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입합니다. 3 x 10⁶ 세포가 들어 있는 바이알은 사용할 때까지 -150°C에서 보관됩니다.

1. 스톡 솔루션 및 media

1. 100μg의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)-0.1% 소 혈청 알부민(BSA)에 희석하여 10μg/mL의 스톡 농도를 갖습니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.

2. PBS-0.1% BSA 10mL에 표피 성장 인자(EGF) 100μg을 희석하여 10μg/mL의 스톡 농도를 만듭니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.

3. 분취량당 100μL의 부피로 50x B27 보충제를 분취량합니다.

4. 10mg의 폴리-L-오르니틴을 100mL의 탈이온수에 희석하여 100μg/mL의 원고 농도를 만듭니다. 1mL 분취량을 만듭니다.

5. 1.20 mg/mL 마우스 라미닌의 30 μL 분취량을 준비합니다.

6. 10mL의 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(0.25%)을 PBS 90mL에 0.025%의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.

7. 트립신 억제제 0.025g을 PBS 50mL에 0.5mg/mL의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.

8. 10μg의 Wnt3a(날개 없는 유형 MMTV 통합 부위 패밀리 멤버 3A)를 1mL의 PBS-0.1% BSA에 희석하여 10μg/mL의 스톡 농도를 갖습니다. 같은 방법으로 BMP4(뼈 형태 형성 단백질 4)를 준비합니다. 100 μL의 부피로 분취합니다.

9. 시클로파민 1mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 2.5mL에 최종 농도 400μg/mL로 희석하고 100μL를 분취량으로 만듭니다.

10. 염기성 배지(표 1) 및 분화 정의 배지(DDM, 표 2)를 준비하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.

2. 배양 접시 코팅<

p style='margin-left:40px;'>1. 증식 또는 분화 중에 GFP-It-NES 세포를 배양하기 위해 접시를 미리 코팅하려면 탈이온수에 폴리-L-오르니틴을 1:100으로 희석하고 T25 플라스크에 용액 5mL를 첨가합니다. 실온(RT)에서 밤새 배양합니다.

2. 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트를 탈이온수로 1회, PBS로 1회 세척합니다.

3. 증식 중인 GFP-It-NES 세포의 경우, 마우스 라미닌을 PBS에서 1:500으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 분화 중인 GFP-It-NES 세포의 경우, 마우스 라미닌을 PBS에서 1:100으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

3. GFP-lt-NES 셀의 확산

1. 두 개의 서로 다른 15mL 튜브에 염기성 배지 5mL(세척용)와 5mL(파종용)를 따뜻하게 합니다.

2. GFP-lt-NES 세포 1바이알을 37°C에서 빠르게 해동하고 세척 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

3. 펠릿을 건드리지 않고 배지를 조심스럽게 흡인하고 예열된 염기성 배지 1mL에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 증식 인자인 EGF(10ng/mL), bFGF(10ng/mL) 및 B27(10ng/mL)가 보충된 염기성 배지가 들어 있는 파종 튜브로 옮깁니다. 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 T25 플라스크에 세포를 시드합니다.

4. 매일 세포에 증식 인자를 공급합니다. 매체가 노란색으로 변하면 교체하십시오. 3일 또는 4일마다 세포를 계대시킵니다(100% 합류에 도달한 후 1일).

4. 증식 및 분화를 위한 GFP-lt-NES 세포 분할<

p style='margin-left:40px;'>1. 플라스크당 5mL의 염기성 배지(세포 수집용)를 예열하고 세포를 다시 파종하는 데 필요한 총 부피를 더합니다.
참고: 계대는 세포를 증식시키기 위해 1:3 희석으로 수행되며, 15mL의 염기성 배지가 필요하고, 분화를 시작하기 위해 1:6 희석으로 수행되며, 30mL의 염기성 배지가 필요합니다.

2. 흡인하여 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 예열된 0.025% 트립신 500μL를 추가합니다. RT에서 5-10분 동안 배양합니다. 세포의 분리는 10배 배율의 표준 광학 현미경으로 확인할 수 있습니다.

3. 같은 부피의 트립신 억제제(최종 농도 0.5mg/mL)를 첨가한 다음 따뜻한 염기성 배지 5mL를 첨가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 수집합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

4. 세포를 증식시키려면 증식 인자가 보충된 신선한 염기성 배지에서 1:3 희석으로 다시 도금하고 1.3.4단계를 반복합니다.

5. GFP-lt-NES 세포의 피질 분화

1. 0일째에 증식 인자가 보충된 염기성 배지 30mL에 세포(분화에 사용)를 재현탁하고 6개의 분화 코팅 T25 플라스크(1:6 분할)에 플레이트합니다.

2. 1일차에 배지의 절반을 DDM으로 변경하고 농도의 절반으로 증식 인자를 추가합니다.

3. 2일째에 배지를 미화 인자인 BMP4(10ng/mL), Wnt3a(10ng/mL) 및 사이클로파민(400ng/mL)이 보충된 DDM으로 완전히 변경합니다.

4. 4일차에는 미분 요소만 추가합니다. 매체가 노란색으로 변하면 교체하십시오.

5. 6일째에 배지를 BMP4 및 Wnt3a가 보충된 DDM으로 변경합니다. 이 단계에서 사이클로파민이 제거됩니다.

6. 7일째에 1.4.2단계 및 1.4.3단계에 설명된 대로 셀을 분리합니다.

2. GFP-lt-NES 세포를 기관형 hACtx 슬라이스로 이식

참고: 성인 인간 피질(hACtx) 조직은 세포 이식 전 1주일 동안 배양되어야 합니다. 이식 절차를 용이하게 하려면 조직이 뜨는 것을 방지하기 위해 인서트 상단에서 2mL의 hACtx 배지를 제거해야 합니다.

1. 피질적으로 프라이밍된 GFP-lt-NES 세포(단계 1.5.6에서)를 차갑고 순수 기저막 매트릭스( 재료 표 참조)에 1 x 105 세포/μL의 농도로 재현탁하고 용액을 더 작은 멸균 튜브로 옮깁니다.

참고: 이식 절차 중에 모든 재료(피펫 팁, 튜브, 모세관 등)는 겔 응고를 방지하기 위해 미리 냉각되어야 합니다. 사용하기 전에 기저막 매트릭스 젤을 얼음 위에서 30분 동안 해동하십시오.

2. 세포 현탁액을 흡입을 위해 고무 젖꼭지에 연결된 차가운 유리 모세관에 모으십시오. 세포 현탁액을 작은 방울(각각 약 1μL)으로 주입하여 다양한 부위에 반건조 조직 조각을 찔러 주입합니다.

3. 겔이 응고될 때까지 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 후드로 다시 옮기고 인서트 상단에 2mL의 hACtx 배지를 조심스럽게 추가하여 조직을 완전히 잠깁니다.

4. 배양 배지를 일주일에 한 번 신선한 hACtx 배지로 교체합니다.

결과

표 1: lt-NES 세포(염기성 배지)의 증식 배지의 구성.

1x		98.7mL	가 포함된 100mL DMEM/F12
당	기본 중	간 농도	농도
N-2 보충제	100x	1:100	1 mL
포도당

L-글루타민 최종

재료

LT-NES 세포 생성

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 신피질 조직의 유지 및 배양 6
웰 플레이트	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex 스캐폴드 6웰 인서트	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 보충제 (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys - 페놀 적색	줄기세포 기술	#05791	텍스트에서 뉴런 배지로 참조됨
필터 단위 250 mL 또는 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
집게	모든 적합한
겐타마이신 (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
글루타맥스 보충제(100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	텍스트에서 L-글루타민으로 참조
고무 젖꼭지 + 유리 피펫	적합한 <
2-메르캅토에탄올 50mM	ThermoFisher Scientific	31350010
동물성 재조합 EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment(50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
소 알부민 분획 V(7.5% 용액)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. 칼시포니쿰	Calbiochem	# 239803
D(+) 포도당 용액(45%)	시그마	G8769
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마 알드리치	D2438-10mL
DMEM/F12	써모피셔 사이언티픽	11320074
덜베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	써모피셔 사이언티픽	14190-144	칼슘 및 마그네슘 라
미닌 마우스 단백질	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 보충제 (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
폴리-L-오르니틴	Merk	P3655
재조합 인간 BMP-4 단백질	R&D 시스템	314-BP-010
재조합 인간 Wnt-3a 단백질	R&D 시스템	5036-WN
피루빈산나트륨(100mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
대두 트립신 억제제, 분말	Thermo Fisher Scientific	17075029
멸균 탈이온수	MilliQ		MilliQ 필터 시스템
트립신 EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 조절
식 용량 피펫 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	다양한
기저막 매트릭스 ESC 인증(Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
원심분리기	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37°C
인큐베이터	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
줄기 세포 절단 도구 0.190-0.210mm	Vitrolife	14601
멸균 튜브	Sarstedt	다양한
멸균 일회용 유리 파스퇴르 피펫 150mm	VWR	612-1701
멸균 피펫 팁 0.1-1000 μL	Biotix VWR	다양한
멸균 혈청학적 피펫 5, 10, 25, 50 mL	Costar	다양한
T25 플라스크 Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

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