방법 논문

마우스 모델에서 안정적인 유전자 변형을 위한 바이러스의 정위 주사

2025년 8월 29일

이 논문에서

초록

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출처: Porlan, E., et al. 신경줄기세포 자율 및 비자율 효과 분석을 위한 성체 마우스 V-SVZ 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 마우스 모델에서 바이러스 운반 치료 유전자의 정위 주입을 통해 심실-뇌실하 영역(V-SVZ)에서 신경 줄기 세포(NSC)의 안정적인 유전자 변형을 보여줍니다. 바이러스는 NSC에 들어가 역전사를 거쳐 게놈에 통합되어 신경치료 응용을 위한 안정적이고 효율적인 유전자 변형을 가능하게 합니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 심실-뇌실하 영역(V-SVZ)/선조체 경계에 측심실(LV)의 정위 주사 또는 좌심실의 좌심실 정위 주사

  1. LV
    1. 수술에 필요한 도구(메스, 드릴 및 작은 핀셋)를 선택하고 멸균합니다.
    2. 수의사가 감독하는 케타민과 메데토미딘의 혼합물을 복강내(ip) 주사하여 6-8주 된 마우스를 마취합니다. 각 동물의 무게를 측정하고 마우스 체중 kg당 50-75mg의 케타민과 0.5-1mg의 메데토미딘을 각각 투여합니다(마우스당 약 100-125μl의 케타민/메데토미딘 작동 용액).
    3. 발가락, 꼬리 또는 귀를 꼬집고 동물이 반응을 보이지 않는지 확인하여 마취 평면을 평가합니다.
    4. 마우스가 마취되면 수술 후 통증을 최소화하기 위해 마우스 체중 kg당 0.4-0.5mg의 최종 용량으로 부토르파놀을 피하 주사합니다.
    5. 귀 사이를 면도하고 요오도포비돈이나 70% 에탄올과 같은 요오도포를 사용하여 피부를 소독합니다. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 클렌징하십시오. 저체온증을 악화시킬 수 있으므로 동물을 과도하게 적시지 않도록 주의하십시오.
    6. 동물을 정위 고정 프레임에 엎드린 자세로 놓고 이어 바와 장치의 입천장 지지대를 사용하여 머리를 조심스럽게 고정합니다. 가열 패드를 37°C로 설정한 마우스를 유지하고 눈에 안과용 윤활제를 바르십시오.
    7. 메스를 이용해 머리 피부를 세로로 1cm 길이의 절개를 하고, 가는 핀셋을 이용해 피부를 부드럽게 집어넣어 두개골을 드러냅니다.
      8. 멸
    8. 균 면으로 끝이 있는 어플리케이터로 뼈 표면을 조심스럽게 청소하십시오. 노출된 두개골의 남은 조직을 청소하십시오.
    9. 주사기 홀더를 사용하여 멸균된 주사기를 정위 장치에 장착합니다.
      10. 주
    10. 사기 바늘의 끝이 시상(세로 및 내측) 봉합사가 관상 봉합사와 수직으로 교차하는 접점인 bregma에 위치할 때까지 x, y 및 z 축을 따라 주사기 홀더를 움직입니다(그림 1b). 배복부(DV) 축의 "영" 위치가 브레그마의 두개골 표면에 있는지 확인합니다.
    11. 주사기를 x 및 y 목적지 좌표로 이동합니다(표 1 및 그림 1b 참조).
    12. 나중에 주입 부위로 돌아올 수 있도록 버니어 눈금에 x, y 및 z 목적지 좌표에 주석을 달습니다. 수술용 마커 펜을 사용하여 x와 y 좌표에 뼈를 표시합니다.
    13. 주사기를 작업 영역에서 멀리 옮깁니다.
    14. 전기 드릴을 사용하여 뇌가 손상되지 않도록 두개골에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 뇌 표면을 손상시킬 수 있으므로 연막 표면에 구멍을 뚫지 마십시오.
    15. 주사기에 106 TU/μl(마이크로리터당 형질도입 단위) 바이러스 용액 1μl를 로드합니다. 끝이 10-12° 각도인 33게이지 날카로운 경사진 바늘을 사용하십시오. 주사기 바늘을 뇌 표면에 대해 90° 각도로 배치합니다.
    16. 주사기를 주사 부위로 다시 옮기고 팁이 농막 표면에 닿을 때까지 아래로 움직입니다.
    17. 주사기로 DV 축의 z 좌표까지 뇌를 관통합니다.
    18. 과도한 유체 압력으로 인한 뇌 조직의 손상을 최소화하기 위해 0.2μl/min의 속도로 바이러스 현탁액을 천천히 방출합니다.
    19. 바이러스 현탁액의 역류를 최소화하기 위해 5-10분 동안 기다린 다음 주사기를 매우 천천히 집어넣습니다.
주입 영역좌표
전후방(AP)중외측(ML)배복부(DV)
SEZ/선조체 경계+0.6mm+1.2mm-3.0mm
측심실-0.3mm+1.0mm-2.6mm




표 1: 주사를 위한 정위 좌표. 전후방(AP) 및 중외측(ML) 축의 경우 x 및 y 좌표는 브레그마로부터의 거리(mm)로 제공됩니다. "-"는 "후방으로"를 나타냅니다. DV 좌표의 경우 "0"은 브레그마 지점에서 두개골의 표면이고 DV 좌표는 이 지점에서 아래쪽 거리(mm)를 나타냅니다.

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결과

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figure-results-1

그림 1: 절차의 여러 부분에 대한 개략적인 표현. (a) LV를 생성하기 위한 적절한 플라스미드를 사용한 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포의 형질감염에서 표시된 공식을 사용한 유세포 분석에 의한 바이러스 역가의 결정에 이르기까지 생체 내 표지 연구를 위한 LV의 생성. 플라스미드와 원심분리기 로터의 이름이 표시됩니다. (b 및 c) 좌심실의 정위 주입. "b"는 정위 기기의 일부이며 미세 측정에 사용되는 장치인 버니어 스케일의 예를 나타냅...

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재료

장비:
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
버니어 정위 기기NeuroLab, Leica39463001
주사기 홀더KD ScientificKDS-311-CE
33-게이지 주사기해밀턴P/N 84851/0085RN
전기 드릴과학 도구98096
열 담요UfesaAL5512/01230-240 V, 100-110 W, 유형 C-AL01
면도기JataMP373N모델: 아름다움, 3 V, 300 mA, 유형 HT-03.
시약:
MedetomidineEsteveDomtor1 mg/ml의 상용 용액.
케타민MerialImalgene 50050mg/ml의 상용 용액
데토미디나/케타민 혼합 염수에 0.2mg/ml 희석액의 최종 농도의 메데토미딘과 최종 농도 15mg/ml의 케타민의 작업 혼합물을 준비합니다. 체중 kg 당 0.5-1 mg 메데토미디나 및 체중 kg 당 50-75 mg 케타민
ButorphanolPfizerTorbugesic. 식염수에서 1 mg/ml의 진통제로 사용됩니다.
0.9% 식염수Braun13465412
수술용 마커 펜Staedler313-9영구 루모컬러
안과용 윤활제 Siccafluid0.5g/dosis, 카보머 974P
포비돈-요오드베타딘694109.610% 포비돈-요오드
<td colspan='4' rowspan='1'> 정밀 메 물 식10 mg/ml의 원액의 최종 농도를 얻기 위해 부피를 주입하는 마취로 사용합니다

재인쇄 및 허가

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