배아 마우스 모델에서 자궁 내 나노주입을 통한 신경판 세포 조작

출처: Mangold, K., H el. al., 배아기 7.5일에 자궁 내 나노 주사(NEPTUNE)에 의한 쥐 신경판 표적화. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 배아 마우스 모델에서 신경판 표적화를 위한 자궁 내 나노 주입 방법을 보여줍니다. 고역가 렌티바이러스 용액을 양강에 주입하여 신경판 세포에 통합하여 신경발달 연구 및 치료 응용을 위한 안정적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사

참고: 이 절차에 사용되는 모든 기구는 수술 전과 각 마우스 사이에서 멸균됩니다.

이상적인 크기의 충치가 있는 첫 번째 여성을 마취합니다.
여성을 테이블 위에 놓고 고정합니다.
각막 건조를 방지하기 위해 눈에 젤을 바르고 진통제를 피하 주사합니다.
참고: 권장 진통제: 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg 체중) 또는 플루닉신(2.5mg/kg) 또는 현지 동물 복지 규정에 따른 유사 진통제. 복합 수술 전후 진통제는 주사된 진통제와 이소플루란으로 유지됩니다.
0.5mg/mL 클로르헥시딘 용액(또는 이와 유사한 것)을 적신 천으로 닦아 하복부를 무균 상태로 준비하고 피부를 건조시킵니다. 수술용 가위를 사용하여 하복부에 1.5-2.0cm 수직 정중선 피부 절개를 합니다.
참고: 현지에서 승인된 소독 루틴에 따라 수술 부위를 준비하십시오.
수술 후 봉합을 용이하게 하기 위해 피부를 부드럽게 들어 올리고 절개 지점 주변 약 1cm의 밑에 있는 근육층에서 피부를 제거합니다.
근육층에 1cm 수직 정중선 절개를 합니다.
한 쌍의 집게로 피부와 근육층의 한쪽을 들어 올리고 다른 한 쌍으로 자궁 뿔을 찾습니다.
참고: 탈락막은 목걸이의 구슬처럼 배열되어 있고 장은 하나의 길고 연속적인 관입니다(그림 1A).
집게를 사용하여 복부에서 양쪽 자궁 뿔을 조심스럽게 빼냅니다. 배아 사이에 조직을 잡습니다. 직접 쥐어짜지 마십시오(그림 1B).
참고: 자궁은 자궁경부에서 신체에 부착되고 두 개의 난소/난관은 인대를 통해 부착됩니다. 이러한 앵커 포인트에서 자궁을 당기거나 분리하지 마십시오.
왼쪽과 오른쪽에 있는 배아의 수를 세고 기록해 둡니다.
난소에서 자궁경부까지 또는 자궁경부에서 난소까지 배아에 번호를 매깁니다.
참고: 이것은 주입된 배아가 배아 단계에서 수집되는 경우 특히 중요합니다.
젖은 면봉으로 주사할 처음 3개를 제외한 모든 배아를 복강으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
페트리 접시의 고무줄에 PBS(인산염 완충 식염수) 한 방울을 놓고 배아 바로 위에 놓습니다.
닫힌 겸자를 고무줄의 절개 부위에 삽입하고 겸자를 풀어 탄성 절개 부위를 열어 액체가 배아에 떨어지도록 합니다.
참고: 이렇게 하면 배아의 수분 보충이 보장되고 탄성 막이 암컷의 젖은 피부에 부착되어 다음 단계에서 PBS가 누출되는 것을 방지합니다.
집게로 고무줄을 통해 3개의 배아에 해당하는 자궁의 일부를 당기고 페트리 접시를 암컷의 복부에 부드럽게 앉힙니다.
집게와 젖은 면봉을 사용하여 자궁 위치와 고무줄을 조정하여 고무줄이 여성의 피부에 밀봉되어 PBS 누출을 방지합니다.
4개의 점토 발을 사용하여 페트리 접시를 복부 바로 위에 고정하고 고정하여 암컷에 가해지는 압력과 암컷의 호흡 및 심장 박동에 대한 영상의 민감도를 줄입니다.
모델링 점토 실린더를 배아/자궁의 오른쪽으로 눌러 자궁을 고정합니다(그림 1C).
참고: 이 방향 지침은 바늘이 암컷의 왼쪽에 있고 암컷의 왼쪽 자궁 뿔의 배아가 노출되어 있다고 가정합니다. 자궁의 측면(왼쪽 또는 오른쪽 자궁 뿔)은 양막(AC)이 바늘(왼쪽 뿔; 그림 1D) 또는 안정화 점토 실린더(오른쪽 뿔; 그림 1E).
오른쪽 자궁 뿔에서 배아를 주입하려면 점토 실린더를 배아의 왼쪽에 놓고(그림 1F) 가열 테이블을 180°(그림 1G)로 돌려 올바른 방향을 얻습니다. 대신 바늘을 움직일 수 있는 경우 관련 설정에 맞게 조정하십시오.
배아와 자궁이 PBS로 덮일 때까지 페트리 접시에 PBS를 추가합니다.
초음파 프로브를 PBS로 내리고 첫 번째 배아가 초음파 프로브와 정렬되도록 마우스/수술 테이블을 조정하여 주사 기록을 용이하게 합니다.
참고: "첫 번째"는 난소에서 자궁경부까지 배아의 번호를 매기는 것을 의미합니다.
세 배아를 모두 스캔하고 AC를 검사합니다. 다음과 같이 주입량을 결정합니다.
1. 초음파 기계로 AC의 직경을 측정합니다. AC 직경이 ≤0.2mm인 경우 69nL을 주입합니다. AC 직경이 >0.2mm 및 ≤0.29mm인 경우 2 x 69nL(= 138nL)을 주입합니다. AC 직경이 0.29mm>인 경우 3 x 69nL(= 207nL)을 주입합니다(그림 1H).
  >참고: 이전 실험에서는 최대 207nL 주입량이 E7.5에서 내약성이 우수하다는 것을 보여주었습니다. 생존에 미치는 영향을 최소화하면서 성공적인 주사는 AC의 상대적 부피 증가가 90%를 초과하지 않을 때 달성됩니다. 새끼 또는 마우스 계통 간의 AC 크기 차이는 일반적이며 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
사출 제어기로 사출 볼륨을 설정합니다.
사출 속도를 23nL/s.
의 주입 속도로 느리게 설정합니다. 참고: 장비 모델에 따라 사출력이 달라질 수 있습니다.
레일 시스템의 메인 휠(x 및 z 평면, 그림 1I)을 사용하여 바늘을 PBS로 내리고 액체가 바늘 끝에 도달할 때까지 나노인젝터 컨트롤러에서 비우기를 누릅니다.
참고: 바늘이 막힌 경우 비우기를 누르면 막힌 부분을 녹이거나 막힌 부분을 제거할 수 있습니다.
PBS에서 바늘을 들어 올리고 Inject를 누릅니다. 대략적인 원하는 부피의 한 방울이 배출되는지 확인하십시오.
바늘을 PBS로 내리고 마이크로 매니퓰레이터의 y-평면 휠로 나노 인젝터를 움직여 초음파 프로브 및 배아에 정렬합니다(그림 1J).
참고: 바늘 끝은 초음파 이미지에 밝은 점으로 나타날 때 완벽하게 정렬됩니다(그림 1K,L). 바늘은 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 세 가지 방향 평면 모두로 이동할 수 있습니다.
입 각도 휠로 바늘 각도를 조정하여 자궁벽에 대해 거의 수직에 가까운 주입 각도를 보장합니다. 마이크로 매니퓰레이터의 주입 휠을 사용하여 한 번에 바늘을 AC에 삽입합니다(그림 1J-M). 바늘 끝의 밝기를 주시하십시오. 바늘 끝이 초음파 이미지에서 사라지면 초음파 프로브를 앞뒤로 움직여 바늘의 초점을 다시 맞춥니다.
참고: 바늘이 AC 내부에 있으면 배아에 해를 끼치지 않고 바늘 위치와 초점을 약간 수정할 수 있습니다(~0.3mm 이내 조정). 이보다 더 바늘 위치를 조정하지 마십시오.
Inject를 누릅니다(207nL의 경우 부피를 69nL로 설정하고 세 번 주입). 주사 후 한 번의 부드러운 움직임으로 바늘을 집어넣기 전에 추가로 5-10초 동안 기다리십시오.
단계를 다음 배아로 이동하고 적절한 AC 크기가 있는 경우 다른 두 배아에 대해 1.22-1.26단계를 반복합니다.
마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 초음파 프로브와 바늘을 PBS에서 들어 올립니다. 손상과 부상을 방지하기 위해 바늘을 작업자로부터 멀리 돌리십시오.
집게를 사용하여 1번째와 2번째 배아를 고무줄을 통해 부드럽게 밀어 암컷의 복부로 다시 보냅니다. 3번째 배아에 인접한 조직을 부드럽게 잡고 자궁을 탄성 절개 부위의 위쪽 끝 쪽으로 당깁니다. 집게로 4-6번째 배아를 부드럽게 당기고 3번째 배아가 복부로 다시 들어가도록 합니다.
참고: 이 단계는 PBS를 변경하거나 페트리 접시를 제거하지 않고도 수행할 수 있습니다.
최적의 AC가 있는 모든 배아가 주입되거나 시간 제한에 도달할 때까지 필요에 따라 반복합니다.
배아/자궁을 암컷의 복부로 부드럽게 밀어 넣습니다.
PBS를 흡인하고 페트리 접시를 제거합니다. 바이러스가 사용된 경우 감염성 폐기물로 처리하십시오.
근육층을 Vicryl(USP 6-0, 바늘 길이 13mm, 3/8 원)으로 단순 연속 또는 단속 봉합사로 함께 꿰매고 1-2개의 클립으로 피부를 닫습니다( 재료 표 참조).
이소플루란 펌프를 끕니다.
수술용 테이프를 제거하고 암컷을 엎드린 자세(배를 아래로 향하게 함)로 40°C 가열판의 깨끗한 케이지에 넣습니다.
참고: 암컷은 10분 이내에 의식을 회복하고 움직일 수 있을 것으로 예상됩니다. 30분 이내에 절차가 완료되었는지 확인하십시오. 여성의 유전적 배경, 나이 및 체중은 마취에 대한 민감도에 영향을 미칠 수 있습니다. 수술 중 마우스를 모니터링하여 느린 호흡(느린 호흡은 마취가 너무 깊다는 것을 의미함) 또는 움직임(마취가 너무 가볍다는 것을 의미함)의 징후를 모니터링합니다. 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg 체중) 또는 플루닉신(2.5mg/kg) 또는 이와 유사한 것은 현지 동물 복지 규정에 따라 필요한 경우 첫 번째 주사 후 8시간 후에 제공될 수 있습니다.
다른 여성에게 주사를 맞출 경우 첫 번째 여성의 각성을 모니터링하면서 수술 부위를 준비하십시오.
1. 수술 도구를 70% 에탄올로 닦아 잔여 혈액이나 조직을 제거하고 예열된 유리 구슬 멸균기에서 10초 동안 멸균합니다. 면봉을 버리고 티슈 페이퍼를 사용하십시오. 페트리 접시와 점토 조각을 티슈 페이퍼로 닦아 말립니다.
모든 암컷이 주사될 때까지 1.1-1.35단계를 반복합니다.
바늘을 비우고 버리십시오.
1. 늘에 바이러스나 주사액이 남아 있으면 나노인젝터에서 비우기를 누르고 티슈 페이퍼에 바늘의 내용물을 비우십시오.
2. 플런저가 완전히 후퇴했음을 나타내는 컨트롤러에서 두 번의 경고음이 울릴 때까지 채우기를 눌러 금속 플런저를 완전히 집어넣습니다.
3. 콜릿을 풀고 바늘을 금속 플런저에서 밀어냅니다. 바늘을 날카로운 폐기물통에 버리십시오.
BSL-2(생물안전 레벨 2) 벤치를 청소합니다.
1. 바이러스를 사용한 경우 전체 수술 부위에 소독제를 뿌립니다( 재료 표 참조). 15분 후 소독제를 닦아내고 70% 에탄올로 수술 부위 전체를 청소합니다. 바이러스를 사용하지 않은 경우 모든 표면을 70% 에탄올로 청소하십시오.
2. 마른 부드러우며 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼로 초음파 프로브에 남아 있는 PBS를 닦아냅니다.
생물안전 지침에 따라 폐기물을 버
초음파 기계, 가열 테이블, BSL2 벤치 및 O₂ 공급 장치를 끕니다.

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 주사기	BD Bioscience	309628
27G 바늘	BD Bioscience	300635
3.5인치 모세혈관	Drummond Scientific	3000203G/X	바늘을 당기는 데 사용되었습니다.
70 MHz MS 시리즈 변환기	Visual Sonics	MS700
Aquasonic 투명 초음파 젤	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 마우스	Charles River, Germany	Crl:CD1(ICR)여성	: 생후 8주부터남성: 생후 12주부터
봉	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
드레싱 겸자 섬세한 스트레이트 13cm	Agnthos	08-032-130
EZ 클립 9mm	Angthos	59027	클립
홍채 가위, 슈퍼 컷, 스트레이트, 9cm	Agnthos	307-336-090
이소플루오란	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	스웨덴 약국에서 구입
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
멤브레인 테이프	Visual Sonics	SA-11053
마이크로피펫 풀러	서터 기기	P-97
모델링 Clay	Sense AB	10209
마우스 핸들링 테이블	Visual Sonics	50249
Nanoject II 자동 인젝터 키트	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
중앙 개구부가 있는 페트리 접시(낮은 벽)	Visual Sonics	SA-11620
페트리 접시, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	소독제
실리콘 멤브레인	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, 핫 비드 살균기	Angthos	31100
수술용 테이프 (1.25 cm x 9.14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air &; O2) 마취 시스템	Visual Sonics	VS-12055
Vevo 이미징 스테이션 2	비주얼 소닉	VS-11983
Vevo2100	비주얼 소닉	VS-20047
비크릴 6-0; C-3 바늘, 45cm 보라색 필라멘트	아그네토스	J384H

배아 마우스 모델에서 자궁 내 나노주입을 통한 신경판 세포 조작

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