전기천공을 통한 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 유전자 전달

초록

출처: Ino, D. et. al., 전기천공에 의한 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 생체 내 유전자 전달. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 전기천공법을 사용하여 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 생체 내 유전자 전달을 보여줍니다. 플라스미드 DNA-염료 용액이 신경에 주입되고 전기 펄스가 DNA 진입을 용이하게 합니다. DNA는 나중에 세포의 게놈에 통합되어 슈완 세포에서 성공적인 유전자 전달을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 플라스미드 DNA의 준비

상

1. 보적 DNA(cDNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 서열을 포유류 세포용 발현 플라스미드로 서브클로닝하여 생체 내 전기천공을 위한 DNA 플라스미드를 생성합니다. 거대세포바이러스 즉각적인 조기 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터 융합(CAG) 프로모터 구동 플라스미드는 강력하고 안정적인 발현을 허용하기 때문에 사용하십시오. CAG 프로모터의 제어 하에 shRNA의 발현을 위해 mir30 기반 shRNA 카세트 시스템을 사용하여 shRNA를 서브클로닝합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 maxi-prep 키트로 플라스미드 DNA를 정제하고 HEPES 완충 식염수(140mM 염화나트륨, NaCl, 0.75mM 인산수소나트륨, Na₂HPO₄, 25mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES); pH 7.40)로 DNA를 재현탁합니다. DNA의 농도를 ≥4 μg/μl로 조정합니다.
3. 플라스미드 DNA 용액을 4μg/μl의 농도로 준비하고 최소량의 빠른 녹색 염료(최종 농도 0.01%)를 첨가하여 주입 부위를 표지합니다. 여러 플라스미드의 동시 전기천공이 필요한 경우 플라스미드 DNA 용액의 총 농도를 4μg/μl로 조정합니다.
   참고: 플라스미드 DNA의 최적 구성은 각 플라스미드의 형질감염 효율에 따라 결정되어야 합니다.

2. 수술 기구 및 식염수

1. 오토클레이브 수술 기구 및 0.9% NaCl 용액

의 멸균.

3. 유리 마이크로피펫 준비

1. 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 당깁니다. 피펫 끝을 직경 30-50μm로 자릅니다. 다음 매개변수를 사용하십시오: 열, 600; 속도, 50; 시간, 75.

4. 동물 수술, DNA 주입 및 전기천공 참고

: 이 단계의 개요는 그림 1에 설명되어 있습니다. 쥐 새끼에 대한 절차가 여기에 설명되어 있지만, 이 방법은 동일한 절차를 사용하는 보다 성숙한 동물에게도 적용할 수 있습니다.

1. 산소 흐름을 0.4L/min으로, 이소플루란 농도를 4%(vol/vol)로 조정하여 동물이 움직이지 않을 때까지 유도 상자에서 이소플루란으로 쥐를 마취합니다. 적절한 마취를 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다.
2. 양안 현미경으로 예열된 보온기에 쥐를 놓고 안면 마스크를 통해 이소플루란을 지속적으로 투여하여 마취를 유지합니다. 산소 유량을 0.2L/min으로 조정하고 이소플루란 농도를 2%(vol/vol)로 조정합니다. 동물의 눈이 뜨고 있는 경우 눈의 건조함을 방지하기 위해 안약을 사용하십시오.
3. 수술용 테이프로 다리를 고정하십시오.
4. 포비돈 요오드로 허벅지 뒤쪽 피부를 깨끗이 닦고 메스로 절개합니다
   참고: 머리카락으로 덮인 경우 수술 부위를 면도하십시오.
재
5. 봉바늘로 대퇴사두근과 대퇴이두근 사이에 구멍을 만들어 좌골 신경을 노출시킵니다.
6. 0.9% NaCl 용액으로 신경을 적십니다. 보푸라기가 없는 종이로 과도한 물을 흡수하십시오.
7. 유리 마이크로피펫의 베이스를 유연한 튜브에 삽입하고 부드럽게 흡인하여 적절한 양의 DNA 용액(최소 1마이크로리터)을 마이크로피펫에 채웁니다.
8. 바늘을 사용하여 신경의 원위쪽을 부드럽게 당겨 노출된 신경을 들어 올립니다.
   알림: 기계적 응력을 최소화하기 위해 신경에 장력을 가하지 마십시오.
9. 유리 마이크로피펫을 신경의 원위 부위에 삽입하고 압력을 가하여(즉, 유연한 튜브의 열린 끝에 불어넣음으로써) DNA 용액을 주입합니다. 신경이 녹색으로 나타날 때까지(최대 1μl) DNA 용액을 주입합니다. 마이크로피펫을 자주 삽입하면 신경이 손상될 수 있으므로 마이크로피펫을 두 번 이상 삽입하지 마십시오.
10. 핀셋 타입의 백금 전극을 신경에서 약 1-2mm 떨어진 곳에 놓습니다. 전극과 신경 사이의 틈을 0.9% NaCl 용액으로 채웁니다.
    알림: 신경에 기계적 응력이 가해지지 않도록 전극으로 신경을 잡지 마십시오.
11. 전극이 있는 전기천공기를 사용하여 주사 부위에 전기 펄스를 가합니다. 첫 번째 펄스 세트 후 전극을 뒤집고 다른 펄스 세트를 적용합니다. 다음 매개변수 사용: 전압, 50V; 펄스 지속 시간, 5msec; 펄스 간격, 100msec; 맥박 수, 4회.
12. 0.9% NaCl 용액으로 전기천공 부위를 청소합니다.

5. 전기천공 후

시

1. 아노아크릴레이트 접착제로 절개 부위를 봉합합니다.
2. 접착제를 말린 후 포비돈 요오드로 상처를 닦으십시오.
3. 안면 마스크에서 강아지를 풀어줍니다. 강아지가 마취에서 완전히 회복될 수 있도록 최소 한 시간 동안 보온기에서 강아지를 데우십시오.

결과

그림 1: 생체 내 전기천공법의 개략도. 먼저 마취된 쥐의 좌골 신경이 노출됩니다. 둘째, 플라스미드 DNA를 좌골 신경에 주입합니다. 셋째, 집게 모양의 전극을 통해 전기 펄스가 주사 부위로 전달됩니다. 마지막으로 상처를 접착제로 봉합합니다. 이 절차는 반대쪽 신경에서 반복할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Genopure 플라스미드 맥시 키트	Roche	03 143 422 001	플라스미드 DNA 정제 키트
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	DNA 주입용 염료
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	유리 모세관
흡입 튜브	Drummond	05-2000-00	마이크로 주입용 흡입 튜브
모델 P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	마이크로피펫 풀러
CUY21 단일 셀	BEX	전기천공기 CUY21 단일 셀	펄스 발생기
전기 워머	KODEN	CAH-6A	수술 중 워머
소플루올라 마일	란 1119701G1076		취제

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