쥐 갈색 세포종 12 세포에서 다공성 실리콘 필름을 이용한 신경 성장 인자의 지속적인 전달

초록

출처: Rosenberg, M., et al. 신경 성장 인자의 운반체로서 다공성 실리콘 필름 설계. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 PC12 세포 분화를 지원하기 위해 신경 성장 인자(NGF)의 지속 방출을 위해 분해성 나노 구조 다공성 실리콘(PSi) 필름을 사용하는 방법을 보여줍니다. NGF는 정전기 상호 작용을 통해 필름의 기공에 흡착되고 확산 및 스캐폴드 분해에 의해 점차적으로 매체로 방출됩니다. 이러한 제어된 전달은 PC12 세포 생존을 촉진하고 장기간에 걸쳐 신경돌기 성장과 분지를 촉진합니다.

프로토콜

1. 산화 다공성 실리콘(PSiO₂) 캐리어 제작

1. 실리콘(Si) 웨이퍼(단면 연마 <100>면, 붕소 도핑이 심한 p형, 0.95mΩ·cm)을 다이아몬드 팁 펜을 사용하여 1.5cm × 1.5cm 샘플로 절단합니다.
2. Si 샘플을 관상로에서 400°C에서 주변 공기에서 2시간 동안 산화시킵니다(가열 속도: 25°C/min, 자연 냉각).
3. Si 샘플을 불산(HF) 수성(48%), 이중 증류수(ddH₂O) 및 에탄올(99.9%)(1:1:3 v/v/v) 용액에 5분 동안 담그고 샘플을 에탄올로 세 번 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.
   참고: HF는 유리를 용해시키므로 HF 용액을 플라스틱 제품에만 준비하여 보관하십시오.
   주의: HF는 부식성이 강한 액체이므로 각별한 주의를 기울여 취급해야 합니다. 노출된 경우 물로 철저히 헹구고 환부를 HF 해독제 젤로 치료하십시오. 즉시 의사의 진료를 받으십시오.
4. 알루미늄 호일 스트립을 후면 접점으로, 백금 코일을 상대 전극으로 사용하여 폴리테트라플루오로에틸렌 에칭 셀에 Si 샘플을 장착합니다.
5. 250mA/^cm2의 정전류 밀도에서 30초 동안 HF와 에탄올(99.9%)의 3:1(v/v) 용액에 희생층을 에칭합니다. 그런 다음 생성된 PSi 필름의 표면을 에탄올로 세 번 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.
6. 갓 에칭된 다공성 층을 수산화나트륨(NaOH) 수용액(0.1M)에 2분 동안 용해시킵니다. 그런 다음 에탄올로 세 번 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.
샘플
7. 을 HF(48%), ddH₂O 및 에탄올(99.9%)(1:1:3 v/v) 수용액에 2분 동안 담급니다. 그런 다음 에탄올로 세 번 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.
8. Si 샘플을 HF 수성과 에탄올(99.9%)의 3:1(v/v) 용액에서 250mA/^cm2의 정전류 밀도로 20초 동안 전기화학적으로 에칭합니다. 그런 다음 생성된 PSi 필름의 표면을 에탄올로 세 번 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.
9. 새로 에칭된 PSi 샘플을 관형로에서 800°C의 관상로에서 주변 공기(가열 속도: 25°C/min, 자연 냉각)에서 1시간 동안 열산화하여 다공성 SiO₂(PSiO₂) 스캐폴드를 형성합니다.
10. PSiO₂ 샘플을 4,000rpm에서 1분 동안 양극의 두꺼운 포토레지스트로 스핀 코팅한 다음 코팅된 샘플을 90°C에서 2분 동안 굽습니다(가열 속도: 5°C/min, 자연 냉각).
11. 다이싱 톱을 사용하여 PSiO₂ 샘플을 8mm × 8mm 샘플로 다이싱합니다.
12. 포토레지스트를 제거하려면 잘게 썬 샘플을 아세톤에 3시간 동안 담그십시오. 그런 다음 에탄올로 철저히 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다.

2. 신경 성장 인자(NGF)로 PSiO₂ 로딩

1. NGF 로딩 용액을 제조하기 위해 쥐 β-NGF 20μg을 0.01 M 인산염 완충 식염수(PBS) 및 ddH₂O의 1:1(v/v) 용액 400μL에 용해시킵니다.
2. PSiO₂ 샘플 위에 52μL의 로딩 용액을 첨가하고 뚜껑이 있는 접시에서 실온(RT)에서 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 배양 중에 용액이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시에서 높은 습도를 유지하십시오.
3. PSiO₂ 담체 내에서 NGF 함량의 후속 정량화를 위해 샘플 위에 용액을 수집합니다.
   참고: PSiO₂로딩하는 NGF 로딩은 의도된 사용 직전에 수행해야 합니다. 단백질의 건조 및 변성의 위험 때문에 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 없습니다.

3. NGF 탑재 PSiO₂ 보인체

1. 쥐 갈색 세포종(PC12) 세포 배양
   1. 10% 말 혈청(HS), 5% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.2% 암포테리신을 Roselle Park Medical Institute(RPMI) 배지에 첨가하여 기본 성장 배지를 준비합니다.
   2. RPMI 배지에 1% HS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.2% 암포테리신을 첨가하여 분화 배지를 준비합니다.
   3. 75 cm² 배양 플라스크에 10 mL의 염기성 성장 배지와 함께 세포 현탁액(10⁶ 세포)을 8일 동안 성장시키고, 2일마다 10mL의 염기성 성장 배지를 플라스크에 첨가합니다.
   4. 분화된 PC12 세포 배양을 생성하기 위해, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고; 200 x g 및 RT에서 8분 동안 세포를 원심분리한다. 상청액을 버린다.
   5. 세포를 5mL의 신선한 염기성 성장 배지에 현탁시키고 200 x g 및 RT에서 5분 동안 세포를 재원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 3mL의 염기성 성장 배지에 재현탁합니다.
   6. 세포 클러스터를 분리하려면 23G 주사기를 사용하여 세포를 10회 흡인합니다.
   7. 혈구계 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산하고 분화 배지가 있는 상태에서 콜라겐 유형 I 코팅 플레이트에 10⁴ cells/cm² 작업 영역을 시드합니다.
   8. 24시간 후, 플레이트당 신선한 쥐 β-NGF(50ng/mL) 또는 NGF 로딩 PSiO₂ 담체를 추가합니다.
      >참고: 더 높은 NGF 농도(>50ng/mL)는 지정된 농도와 정확한 효과를 갖습니다.
   9. 2일마다 감화 배지를 갱신하십시오.
   10. 세포 생존력을 평가하기 위해, 대표적인 시점에 생존율 지표 용액(레사주린 기반)의 10%(v/v)를 첨가하고 37°C에서 5시간 동안 배양하고, 분광 광도계를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세톤	가돗	830101375
암포테리신	생물학적 산업	03-028-1B
성 HF(48%)	Merck	101513
AZ4533 포토레지스트	메탈 켐, Inc.	AZ4533
BSA 분획 v	MP 생물 의학	216006950
BSA 용액(10%)	생물 산업	03-010-1B
콜라겐 유형 l	Corning Inc.	354236
콜라게나제	Enco	LS004176
콜라겐 코팅 플라스틱 커버슬립	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-포도당	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
에탄올 무수(99.9%)	머크	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidine-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
햄의 F-12 영양 혼합	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 중간	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-글루타민	Biological Industries	03-020-1A
쥐 β-NGF	Peprotech	450-34-20
일반 당나귀 혈청(NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
파파인	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS(pH 7.4)			10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl을 이중 증류수(ddH₂O, 18 MΩ·cm)에 용해하여 제조합니다.
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
PC12 세포주	ATCC	CRL-1721
Penicillin-streptomycin	Biological Industries	03-032-1B
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
PrestoBlue 시약	Thermo Scientific	A13261
RPMI 매체	생물 산업	01-100-1A
Si 웨이퍼	Siltronix Corp.		고도B도핑, p형, 0.00095 Ω-cm 저항률, <100> 배향
지드나트륨	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
수산화나트륨(NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
탄닌산	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

아 수물 아

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