마우스 해마 절편 배양에서 단일 세포 전기천공법을 통한 유전자 발현

초록

출처: Keener, D. G., et al. 마우스 해마 흥분성 및 클래스 특이적 억제 뉴런의 다양한 기관형 절편 배양에 걸친 단일 세포 전기천공. J. Vis. 경험. (2020).

이 비디오는 마우스 해마 절편 배양 내의 뉴런에 플라스미드 DNA를 도입하는 단일 세포 전기천공 과정을 보여줍니다. 이 절차에는 정확한 피펫 위치 지정, 압력 조정 및 전기천공 펄스가 포함되어 신경막을 일시적으로 투과시켜 유전자 전달을 촉진합니다. 전기천공 후, 슬라이스를 배양하여 도입된 관심 유전자의 발현을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 슬라이스 배양 준비

성

1. 별에 관계없이 출생 후 6-7일 생후 마우스를 사용하여 이전에 설명한 대로 마우스 기관형 해마 슬라이스 배양을 준비합니다.
   탈
   1. 이온수에서 자당 238, KCl 2.5, CaCl₂ 1, MgCl₂ 4, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1 및 포도당 11로 구성된 기관형 슬라이스 배양을 위한 해부 배지를 준비한 다음 5% CO₂/95% O₂를 사용하여 pH 7.4로 가스를
   준비합니다.
   2. 78.8%(v/v) 최소 필수 배지 Eagle, 20%(v/v) 말 혈청, 17.9mM NaHCO₃, 26.6mM 포도당, 2M CaCl₂, 2M MgSO₄, 30mM 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산(HEPES), 인슐린(1μg/mL) 및 0.06mM 아스코르브산, pH 7.3으로 조정된 기관형 슬라이스 배양 배지를 준비합니다. 삼투압계를 사용하여 삼투압을 310-330 삼투압으로 조정합니다.
   3. 두 개의 주걱을 사용하여 전체 뇌에서 해마를 해부하고 조직 다지기를 사용하여 슬라이스(400μm)합니다. 두 개의 겸자를 사용하여 슬라이스를 분리하고....

결과

그림 1: 두 개의 대표적인 유리 피펫 이미지. (A) 이 프로토콜에 사용되는 저저항(6.5MΩ) 피펫과 (B) 전기천공 프로토콜에 일반적으로 사용되는 고저항(10.4MΩ) 피펫을 표시합니다.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 준비
제 키트	Qiagen	12362
기관형 슬라이스 배양 준비
6 웰 플레이트	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 집게	FST	#5/45	기관형 슬라이스 배양 준비를 위한 각진 해부 겸자
스크 필터 장치	Millipore	SCHVU02RE	배양 배지의 여과 및 보관
인큐베이터	바인더	BD C150-UL
McIlwain 티슈 쵸퍼	TED PELLA, INC.	10180	기관형 슬라이스 배양 준비용 조직 초퍼
리셀 세포 배양 인서트, 30mm	밀리포어	PIHP03050	기관형 슬라이스 배양 인서트
삼투압계	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE 코팅 주걱	Cole-Parmer	SK-06369-11
가위	FST	14958-09
실체 현미경	Olympus	SZ61
멸균 진공 여과 시스템	Millipore	SCGPT01RE	aCSF
전극 준비
모세관 안경	Warner Instruments	640796
마이크로 피터 풀러	서터 기기	P-1000	풀러
오븐	바인더	BD (E2)
풀러 필라멘트	서터 기기	FB330B	풀러
단일 셀 전기 천공
3.5mm 팔콘 페트리 접시	BD 팔콘	353001
에어테이블	TMC	63-7512E
전기천공 시스템	자 장치	축소 포레이터 800A	전기천공기

플라스미드 정 플라 밀 의 여과 및 보관 분