마우스 해마 절편 배양에서 단일 세포 전기천공법을 통한 유전자 발현

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 슬라이스 배양 준비

1. 별에 관계없이 출생 후 6-7일 생후 마우스를 사용하여 이전에 설명한 대로 마우스 기관형 해마 슬라이스 배양을 준비합니다.
   탈
   1. 이온수에서 자당 238, KCl 2.5, CaCl₂ 1, MgCl₂ 4, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1 및 포도당 11로 구성된 기관형 슬라이스 배양을 위한 해부 배지를 준비한 다음 5% CO₂/95% O₂를 사용하여 pH 7.4로 가스를
   준비합니다.
   2. 78.8%(v/v) 최소 필수 배지 Eagle, 20%(v/v) 말 혈청, 17.9mM NaHCO₃, 26.6mM 포도당, 2M CaCl₂, 2M MgSO₄, 30mM 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산(HEPES), 인슐린(1μg/mL) 및 0.06mM 아스코르브산, pH 7.3으로 조정된 기관형 슬라이스 배양 배지를 준비합니다. 삼투압계를 사용하여 삼투압을 310-330 삼투압으로 조정합니다.
   3. 두 개의 주걱을 사용하여 전체 뇌에서 해마를 해부하고 조직 다지기를 사용하여 슬라이스(400μm)합니다. 두 개의 겸자를 사용하여 슬라이스를 분리하고 인서트 아래에 배양 배지(950μL)로 채워진 6웰 플레이트의 30mm 세포 배양 인서트로 옮깁니다.
2. 기관형 슬라이스 배양액을 조직 배양 인큐베이터(35°C, 5% CO₂)에 보관하고 이틀마다 슬라이스 배양 배지를 교체합니다.

2. 플라스미드 준비

1. 관심 유전자에 대한 플라스미드를 준비합니다.
   1. 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자를 pCAG 벡터로 서브클론합니다.
   2. 내독소가 없는 정제 키트로 pCAG-EGFP 플라스미드를 정제하고 140mM K-메탄술폰산염, 0.2mM 에틸렌글리콜 테트라아세트산(EGTA), 2mM MgCl₂ 및 10mM HEPES를 함유한 디에틸 피로카보네이트 처리수로 구성된 내부 용액에 용해시키고, KOH(플라스미드 농도: 0.1μg/μL)로 pH 7.3으로 조정합니다.

3. 유리 피펫 준비

1. 마이크로피펫 풀러에서 붕규산 유리 피펫(4.5 – 8MΩ)을 당깁니다(그림 1A).
   참고: 전체 세포 패치 클램프 기록에 사용되는 유리 피펫은 전기천공에 이상적입니다.
2. 유리 피펫을 200°C에서 밤새 구워 멸균합니다.
해
3. 부 현미경으로 피펫 팁의 크기를 확인하여 전기 저항을 대략적으로 측정합니다.
   1. 선택 사항:피펫을 전기천공 전극에 부착하여 피펫 저항을 확인하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ 및 11 글루코스를 함유한 탈이온수에 넣고 pH 7.4로 가스화합니다. 전기천공기의 판독값을 사용하여 실제 저항을 확인합니다.
      참고: 피펫 팁이 날카로울수록 전기 저항이 커집니다. 피펫 저항은 10MΩ 미만이어야 합니다. 피펫 저항이 높은 유리 피펫(그림 1B)은 반복적인 전기천공 중에 팁이 막히는 경우가 많습니다.

4. 전기천공 장비 설정

1. 이동 테이블에 장착된 정립 현미경, 미세 조작기 및 연동 펌프가 장착된 표준 전체 세포 전기생리학 장비에 전기천공기를 설치합니다.
헤드
2. 를 설치tage 전기천공기기의 마이크로매니퓰레이터에 한 쌍의 스피커를 전기천공기기에 연결합니다. 준비가 되면 펄스를 보내는 데 사용할 수 있는 풋 페달에 전기천공기를 연결합니다.
   알림: 스피커를 켤 때 전극의 전기 저항을 나타내는 신호음이 납니다. 이를 통해 절차에서 주의를 돌리지 않고 저항의 상대적 변화를 결정할 수 있습니다.

5. 전기천공 준비

1. : 슬라이스 배양 인서트를 6웰 플레이트에서 900μL의 배양 배지가 로드된 3cm 페트리 접시로 옮기고 전기천공을 수행할 준비가 될 때까지 탁상용 CO₂ 인큐베이터에 보관합니다.
   1. 신선한 배양 인서트를 슬라이스 배양 배지(1mL)와 함께 3.5cm 페트리 접시에서 최소 30분 동안 사전 배양하여 전기천공 후 슬라이스를 배양합니다.
2. 전기천공을 위해 장비를 청소하고 준비합니다.
   1. 당일 실험을 시작하기 전에 10% 표백제로 5분 동안 라인을 관류하여 튜브와 챔버를 멸균합니다.
   2. 완전히 헹구기 위해 최소 30분 동안 탈이온화된 고압멸균수로 라인을 관류합니다.
   3. 0.001mM 테트로도톡신(TTX)을 함유한 필터 멸균 aCSF로 라인을 관류합니다.
      참고: TTX는 중간 뉴런의 과흥분으로 인한 세포 독성 및 사멸을 최소화합니다.
3. 전기천공기기의 펄스 매개변수(진폭 5V, 사각 펄스, 트레인 500ms, 주파수 50Hz, 펄스 폭 500μs)를 설정합니다.
4. 유리 피펫에 플라스미드 함유 내부 용액 5μL를 채웁니다.
   팁을
   1. 여러 번 튕기고 부드럽게 두드려 피펫 팁에 갇힌 기포를 제거합니다.
   2. 해부 현미경으로 팁을 시각화하거나 3.3.1단계를 반복하여 피펫 저항을 확인하여 팁이 손상되었는지 확인합니다.
      참고: 팁이 손상된 경우 유리 피펫을 폐기해야 하며 3단계에서 이전에 준비한 새 유리 피펫으로 이 단계를 반복해야 합니다.
5. 피펫 팁을 전극에 단단히 부착하고 스피커를 켭니다. 팁이 aCSF 배지와 접촉했을 때 전기천공기의 판독값(피펫의 저항)을 기록합니다.
6. 날카로운 칼날을 사용하여 배양 삽입물 멤브레인을 자르고 배양액 한 조각을 분리합니다. 날카로운 각진 겸자를 사용하여 슬라이스 배양액을 전기천공 챔버로 조심스럽게 옮기고 슬라이스 앵커로 위치를 고정합니다.
   1. 신경 건강 또는 기능 변화와 같은 부작용을 방지하기 위해 슬라이스 배양액을 한 번에 30분 이상 인큐베이터 외부에 보관하지 마십시오.

6. 관심 있는 전기천공 세포

1. 입으로 또는 튜브에 부착된 1mL 주사기(0.2 - 0.5mL 압력)를 사용하여 피펫에 양압을 가합니다.
2. 마이크로매니퓰레이터의 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 슬라이스 배양 표면 근처에서 피펫 팁을 조작합니다.
3. 표적 세포를 선택하고 현미경으로 볼 수 있는 세포 표면에 딤플이 형성될 때까지 양압을 가한 상태로 접근합니다.
4. 압력 사이클을 수행합니다.
   피펫
   1. 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 입으로 약한 음압을 빠르게 가합니다. 스피커에서 나오는 톤의 증가를 들음으로써 피펫 저항의 증가(초기 저항의 ~2.5배)를 관찰하십시오. 보조개가 다시 형성되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오.
   즉시
   2. 일시 중지 없이 최소 두 번의 압력 사이클을 더 완료한 다음 1초 동안 음압을 유지합니다.
      참고: 사이클 사이에 일시 중지하거나, 너무 많은 압력을 가하거나, 음압을 너무 오래 유지하면 심각한 세포 손상이 발생할 수 있으며 전기천공 중에 세포가 죽을 수 있습니다.
5. 스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 전기 천공기를 한 번 빠르게 펄스하여 최대 전기 저항을 나타냅니다. 펄스를 보내기 전에 피크 저항에서 1초 이상 기다리지 마십시오.
   참고: 이 프로토콜을 사용할 때 표적 이탈 전기천공법이 관찰되지 않았습니다. 압력 주기 동안 유리 피펫과 접촉하는 세포만 형질감염되었습니다. 피펫을 다른 뉴런 근처에 배치해도 유전자 형질감염이 발생하지 않습니다.
6. 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100μm 떨어진 곳에서 부드럽게 집어넣습니다.
7. 저항이 5.5단계에서 기록된 판독값과 유사한지 확인하면서 양압을 다시 적용한 다음 다음 셀에 접근합니다.
   >
   1. 양압을 가하여 전기천공 후 피펫 저항이 크게 증가(>15% 더 높음)으로 시각적으로 표시되는 잠재적인 막힘을 제거합니다.
      >참고: 눈에 보이는 막힘이 없고 저항이 여전히 상당히 높으면 피펫을 버리고 새 피펫을 사용하십시오. 평균적으로 피펫은 사용자가 주의하면 최대 20개의 전기천공 이벤트에 사용할 수 있습니다.
8. 전기천공 후, 슬라이스 배양액을 신선한 배양 인서트에 옮기고 인큐베이터에서 35°C에서 최대 3일 동안 배양합니다.

그림 1: 두 개의 대표적인 유리 피펫 이미지. (A) 이 프로토콜에 사용되는 저저항(6.5MΩ) 피펫과 (B) 전기천공 프로토콜에 일반적으로 사용되는 고저항(10.4MΩ) 피펫을 표시합니다.