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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 경추동맥류 클립 타박상/압박 모델
- 수술 전 기구를 오토클레이브하고 전체 수술 과정에서 70% 알코올 수조에 넣어 멸균 상태로 유지하십시오.
- Wistar 쥐(250-270g)를 산소(O2), 아산화질소(N2O)(1:1) 및 1.8-2.2% Isoflurane의 조합으로 마취하고 가스 마취 마스크를 통해 자발 호흡을 지원합니다. 마취 유도를 위해 5% 이소플루란으로 1분 동안 시작한 후 감소시킵니다. 수술을 시작하기 전에 고통스러운 자극(예: 발)을 주어 마취 깊이를 조절하십시오. 건조함을 피하고 후속 감염을 예방하기 위해 눈에 지방이 많은 연고를 바르십시오.
- 쥐를 가열 쿠션(37°C)에 놓고 머리를 정위 프레임에 고정합니다.
- 경추 주변의 수술 부위를 면도하고 포비돈 요오드와 70% 알코올로 소독합니다.
- 경추(C2)에서 흉추체2(T2)의 돌출된 돌기에 도달하는 척추 위의 정중선 절개를 합니다.
정- 중선에서 척추 근육의 바깥층을 두개골-꼬리 방향으로 직접 절단하고(출혈을 피하기 위해) 더 깊은 근육층을 추가로 부드럽게 해부합니다. 견인기를 삽입합니다.
- 척추체 T2의 돌출된 돌기근의 방향을 지정하여 추궁 절제술의 목표 수준을 관찰합니다. 선택한 박판을 식별하고 미세 수술로 준비한 후 flamenti flavae를 절단하여 박판과 돌기(processus spinosus)를 느슨하게 합니다. 마지막으로 척수 측면의 뼈 깎기로 박판을 자르고 척수 자체가 압박되지 않도록 부드럽게 제거합니다.
참고: 가장 일반적인 수준은 C5/6, C6/7 또는 C7/T1입니다. 수술 전후 사망률은 부상 수준이 주둥이가 많을수록 증가합니다. 척추주위 정맥동에서 출혈하는 것은 흔하며 스펀지로 조심스럽게 압박하여 해결할 수 있습니다. - 탯줄에 외상을 입히기 위해 클립을 삽입하기 전에 새로운 신경근을 식별하여 클리핑을 방지하십시오(특히 레벨 C5/6에서).
- 원활한 클립 유도를 위해 후크로 척추체의 등쪽에서 복부 경막을 풀고 클립을 위한 복도를 준비합니다.
- 마지막으로 열린 클립을 삽입하고 찰칵 소리를 내고(급속 닫힘) 타박상 부상을 입힙니다. 클립 폐쇄력과 클립 폐쇄 기간은 외상의 강도와 압박 정도를 결정합니다. 일반적으로 사용되는 것은 15-35g 사이의 클립력과 1분의 클리핑 지속 시간입니다(그림 1).
- 클립을 제거한 후 근육을 2겹으로 조정하고 상처를 봉합합니다.
- 마취를 중단하고 흉골 누운 자세를 취하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 지속적인 관찰 하에 동물이 깨어나도록 하십시오. 마지막으로 쥐를 단일 케이지에 넣고 수술 후 치료 지침을 따릅니다.
- 동물은 이러한 유형의 부상의 심각성으로 어려움을 겪기 때문에 수술 후 치료에 특별한 주의를 기울여야 합니다.
진- 통제(부프레노르핀과 멜록시캄을 각각 3일, 5일 동안 임상 증상에 따라
투여).- 3일 동안 추가 식염수를 피하 투여합니다(1일 2회, 5-10밀리리터(ml)).
- 수술 2일 전부터 수술 후 7일까지 식수에 항생제를 투여합니다(예: Moxifloxacine).
- 방광 기능의 회복이 지속적으로 명백해질 때까지 하루에 2-3회 방광을 압착합니다.
- 수술한 동물의 신경학적 결손과 생리적 상태를 하루에 한 번 이상 관찰하십시오.
2. SAP 및 NPC 주입(손상 후 14일)
- 1.1 내지 1.3에 기재된 대로 마취를 유도하고, 쥐의 머리를 정위 프레임에 고정하고, 꿰매거나 상처 클립을 제거하고, 포비돈-요오드와 70% 알코올로 상처 및 수술 부위를 소독한다.
- 척추주위 근육을 조심스럽게 해부하고, 견인기를 삽입하고, 경막에서 현미경으로 흉터 조직을 제거하고, 병변 부위를 다시 노출시킵니다.
- 세포외 매트릭스 겔을 수행하기 위해 1%(w/v) 농도로 SAP를 준비합니다. QL6 SAP는 생리학적으로 호환되는 pH를 가지며 주입 전에 완충할 필요가 없습니다. 척수에서 SAP를 시각화하려면 QL6의 형광 유도체(QL6-플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC])를 사용하십시오.
- SAP(5마이크로리터(μl))를 병변 중앙에 주입하고 정중선의 양측으로 각각 2.5μl씩 2부분으로 분포합니다. 마이크로 유리 모세관(외경[OD] 100마이크로미터(μm) 외경[OD])이 있는 정위 프레임에 연결된 해밀턴 주사기를 사용하십시오. 날카로운 바늘 끝으로 경막을 조심스럽게 열고 유리 모세혈관을 외상을 입은 척수에 정위적으로 2mm(mm) 삽입합니다.
- 부피의 1/3을 주입한 후 바늘을 1.5mm 깊이까지 제거하고 1/3에서 1mm 더 제거합니다. 전체 부피를 주입한 후 주사기를 제거하기 전에 겔 형성을 안정화할 때까지 5분 정도 기다리십시오.
- NPC를 생성하기 위해, 성체 원간판 적색 형광 단백질(DsRed) 마우스(또는 황색 형광 단백질[YFP]-양성 마우스, 녹색)를 사용하여 뇌실주위 영역에서 분리 및 배양합니다.
- 세포 현탁액에 ~90%의 살아있는 세포가 존재함을 나타내는 트리판 블루 염색으로 NPC의 생존력을 평가합니다. 성장 배지(50 x 10,3 살아있는 세포/μl)에서 세포를 희석한 다음 세포 이식에 사용합니다.
- 손상 부위의 2mm 주둥이와 꼬리 쪽에서 양측으로 4개의 2μl(총 부피 8μl, 4 x 105 NPC 포함)를 척수내 주사합니다. 경막을 연 후 척수 등쪽 표면 아래 1.5mm에 Hamilton 마이크로 유리 모세관을 삽입하고 세포 현탁액 2μl를 주입합니다. 약 0.5 μl/min(min)의 주입 속도를 선택하십시오.
- 각 주사가 끝날 때와 탯줄에서 모세혈관을 제거하기 전에 최소 1분 동안 기다렸다가 조직이 새로운 세포 부피를 수용할 수 있도록 늘어납니다. (그림 2)
