마우스의 수면에서 각성으로의 전환을 위한 신경 회로의 광유전학적 조작

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 수술, 바이러스 주입, EEG/EMG용 전극 및 광섬유 이식

주의: 사용할 바이러스의 생물학적 안전 수준에 따라 적절한 보호 및 취급 기술을 선택해야 합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 주사를 위해 격리된 P1A 등급 실에서 사용해야 하며, AAV를 운반하는 튜브는 모든 부피를 사용한 후 오토클레이브로 멸균해야 합니다. 수술 부위와 모든 이식 재료는 사용 중에 깨끗하고 멸균되어야 합니다.

참고: 그림 1을 참조하십시오.

1. 오토클레이브로 수술 장비를 소독합니다.

2. 마취 기화기를 사용하여 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 집게로 꼬리를 꼬집는 것에 대한 반응 상실에 의해 결정되는 마우스가 원하는 마취 깊이에 도달할 때까지 관찰하십시오. 눈이 건조해지지 않도록 안과용 연고를 눈에 바르십시오.

3. 요오드 용액 또는 70% 에탄올(EtOH, 3x)으로 수술 부위를 소독하고 충분히 건조시킵니다. 수술이 진행되는 동안 바이러스가 얼음 위에서 해동되도록 하십시오. 흡수성 실험실 벤치 종이로 수술 부위를 덮습니다.

4. 이어바와 코 꼬집기로 정위 장치에 마우스의 머리를 고정합니다. 머리가 안정적으로 잡혀 있는지 확인한 후 두피에 시상 중간 절개를 하여 브레그마와 람다의 위치가 수평선에서 같은 높이에 위치하도록 합니다.

5. 위치 간격을 피하려면 코 핀치와 이어바의 레벨을 위아래로 적절하게 조정하십시오. bregma와 lambda는 각각 sutura saggitalis와 sutura coronalis 또는 sutura lambdoidal 사이의 교차점을 나타냅니다(그림 2).

6. 세라핀 클램프를 사용하여 두개골에 대한 접근을 유지하기 위해 피부를 잡습니다. 두개골을 노출시킨 후 두개골 표면을 요오드 또는 5% H₂O₂로 소독하여 브레그마와 람다를 포함한 두개골 봉합사를 보다 명확하게 시각화

7. AAV 벡터 주입을 준비합니다.

1. 10mL 주사기 내부( 재료 표 참조)를 70% EtOH, 100% EtOH 및 멸균수로 각각 5회 순차적으로 세척합니다. 미세 주입 펌프 암의 클램프에 주사기를 고정하고 주사기의 모든 용액이 배출되었는지 확인합니다.

2. 기포 없이 미네랄 오일 2μL를 조심스럽게 흡인한 다음 지정된 부피의 바이러스 용액을 흡인합니다. 흡인 후 플런저 버튼을 조작하여 바늘 끝에서 바이러스 용액이 나오는지 확인합니다.

참고: 바이러스 용액의 주입량은 동일한 마우스 계통 및 동일한 바이러스 제품을 사용한 파일럿 실험에서 결정되었습니다. 바이러스 용액의 부피와 감염 부위의 범위 사이의 관계는 미리 추정해야 합니다.

8. AAV vector:

1을 삽입합니다. 브레그마의 미세 주입 바늘 끝을 조정하고 좌표를 원래 지점으로 기록합니다. 팁을 지정된 주사 부위(BNST의 경우: 전후 + 0.2mm, 내측 ± 1.0mm, 배복부 - 4.2mm)로 이동하고 바늘 끝을 해당 위치에 놓습니다. 두개골에 표시를 하고 0.7mm 카바이드 커터가 있는 치과용 드릴을 사용하여 직경 약 2mm의 구멍을 뚫습니다. 경막이나 뇌 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

2. 면봉으로 구멍 주변의 피를 제거한 후 바늘을 BNST 위치로 천천히 움직입니다. 기계식 마이크로인젝터로 지정된 양의 바이러스 용액(0.07μl/min)을 천천히 주입합니다. 주사를 마친 후 용액이 BNST 조직에 충분히 침투할 수 있도록 바늘을 5분 동안 그대로 둡니다. 바늘을 조심스럽게 제거하십시오.

3. 양측 주입의 경우 반대쪽에서 1.8.1-1.8.2단계를 반복합니다. 절차 전반에 걸쳐 멸균 식염수를 적용하여 두개골을 촉촉하게 유지하십시오.

참고: 맞춤형 뇌파검사(EEG)/근전도(EMG) 임플란트(너비: 5mm, 깊이: 7mm, 높이: 1mm)를 4개의 EEG 전극(4mm), 2개의 EMG 전극(2mm, 니퍼로 4mm 전극을 2mm로 절단) 및 6개의 전극(4.5mm)과 함께 사용했습니다(그림 2A).

9. 절연체의 양쪽 끝에서 1mm가 벗겨진 두 개의 스테인리스 스틸 와이어( 재료 표 참조)를 EMG 전극에 납땜합니다. 전극의 중심을 브레그마에 맞추고 각 EEG 전극의 위치(전후 ± 1.5mm, 내측 ± 1.0mm)를 표시하고 임플란트의 위치를 결정합니다(그림 2B).

10. 임플란트 광섬유:

1. 광섬유 페룰을 매니퓰레이터에 부착하고 매니퓰레이터 암을 회전시켜 수평선에 대해 ±30°의 각도가 되도록 합니다(이 프로세스는 BNST 자극의 경우와 같이 전극과 광섬유 사이의 간섭을 피하기 위해서만 필요함). 섬유 끝을 브레그마에 놓고 좌표를 기록합니다.

2. 팁을 대상 삽입선으로 이동하고 두개골의 위치를 표시합니다. 또한 앵커 나사 삽입 부위 근처에 추가 표시를 하십시오. 치과용 드릴로 각 부위의 두개골을 뚫어 광섬유를 삽입하고 나사를 고정합니다. 두개골에 나사를 고정합니다. 나사로 경막이 부러지거나 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

3. 매니퓰레이터로 BNST 위에 도달할 때까지 광섬유를 부드럽게 삽입합니다. 페룰은 나머지 두개골 위에 놓여야 합니다(그림 1B).

4. 광경화성 치과용 시멘트( 재료 표 참조)를 도포하여 섬유와 나사를 덮습니다. 접착제를 응고시키는 반응 시간은 제조업체의 설명서에 명시되어야 합니다(당사의 재료는 특정 파장 광 발생기를 사용하여 최소 10초 동안 빛에 노출되어야 합니다. 이 후에는 접착제를 건조시킬 필요가 없습니다).

5. 이 단계에서는 전극의 장착 공간을 차지하는 재료(나사 또는 접착제)가 없는지 확인합니다. 또한 광섬유 및 케이블에 연결하는 페룰의 시멘트가 중단되지 않도록 하십시오. 양측 자극을 위해 반대쪽에서 1.10.1-1.10.4단계를 반복합니다.

11. EEG/EMG 전극용 구멍을 뚫습니다. 전극의 끝을 구멍에 삽입합니다. 임플란트를 잡고 두개골과 전극 사이의 공간에 시아노아크릴레이트 접착제를 도포합니다. 재료에 방해가 되지 않도록 주의하여 다시 삽입하십시오.

12. 전극과 광섬유의 둘레를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮은 다음 접착제에 시아노아크릴레이트 촉진제를 도포합니다. 이 단계는 페룰-광 케이블 및 전극-리드선 연결 영역에서 중단을 방지합니다(그림 1C).

참고: 시아노아크릴레이트 접착제와 그 촉진제는 마우스 눈에 해롭습니다. 이러한 화학 물질이 유출되지 않도록 주의하십시오. 또한 접착제 응고 직후 예상치 못한 편차를 피하기 위해 전극과 섬유에 강하게 닿지 않도록 주의하십시오.

13. 마우스 목 근육을 노출시키고 근육 아래에 EMG 전극용 와이어를 삽입합니다. EMG 전극의 길이를 조정하여 목덜미 근육 바로 아래에 위치하도록 합니다. 전극 끝과 근육 근막 사이의 가벼운 연결만으로도 EMG 신호를 포착하기에 충분합니다.

14. 시아노아크릴레이트 접착제를 도포하여 임플란트를 채우고 접착제를 가속액으로 응고시킵니다. 그런 다음 자세 반사가 나타날 때까지 회복을 위해 마우스를 가열 패드 위에 올려 놓습니다. 가열 패드 온도를 동물의 휴식 체온으로 조정합니다(C57BL6 마우스의 경우 ZT 0-12에서 36.0°C, 38.0°C를 초과하지 마십시오).

참고: 멸균 수술에는 항생제가 필요하지 않습니다. 수술 후 진통에 대한 현지 기관 지침을 따르십시오. 최소 7일의 회복 기간 동안 생쥐를 가정용 케이지에 보관하십시오.

2. 특정 수면 상태에서 표적 뉴런의 광 여기를 통한 EEG/EMG 모니터링

주의: 이 프로토콜에는 클래스 3B 레이저 장비 또는 LED 장치의 사용이 포함됩니다. 실험자는 안전 정보를 알고 있어야 합니다. 보안경이 필요합니다.

1. 레이저 케이블을 광섬유에 연결하기 전에 스케일러로 레이저 강도를 조정하십시오. 페룰을 사용하여 레이저 케이블의 끝을 사용하지 않는 광섬유에 묶고 광섬유와 케이블 사이의 접합부에 공간이 없는지 확인합니다.

2. 레이저의 메인 스위치를 켜고 예열될 때까지 20분 정도 기다립니다.

3. 레이저를 강도 검사기로 방출하고 레이저 강도를 10mW/mm로 조정합니다^. 레이저 모드를 트랜지스터 로직으로 변경하고 지속 시간 10ms, 휴식 시간 40ms, 주기 20회 및 20회 반복(즉, 20초 동안 10ms 광 펄스의 20Hz)으로 설정된 패턴 레귤레이터에 의해 제어되는 광섬유에서 광 펄스가 방출되는지 확인합니다.

4. 회복 기간이 지나면 마우스를 EEG/EMG 기록을 위한 실험실로 이동합니다. 집 쥐는 음식과 물을 자유롭게 사용할 수 있는 12시간의 빛/암 주기로 일정한 23°C로 유지되었습니다.

5. 엉킴을 방지하기 위해 슬립 링에 묶인 이식된 전극과 케이블 어댑터를 연결합니다. 레이저 누출을 방지하기 위해 알루미늄 호일과 같은 불투광성 재료로 접합부를 덮는 것이 좋습니다. 양측 실험이 필요한 경우 케이블에 분기 부착물이 있는 슬립 링을 사용하십시오.

6. 이 프로토콜에서는 NREM(Non-Rapid Eye movement) 수면 또는 REM(Rapid Eye Movement) 수면에서 각성까지의 잠복기를 평가하므로 기록 시간은 최적화된 시대 시간으로 제한되어야 합니다(ZT0은 조명이 켜져 있는 시간으로 정의됨). 이 프로토콜은 ZT4 - ZT10 사이에 수행되었습니다. 적응을 위해 마우스를 실험실에 최소 1시간 동안 자유롭게 머물게 합니다.

7. 실험 기간 동안 동일한 모니터에서 EEG 및 EMG 신호를 모니터링하고 마우스의 상태를 각성, NREM 수면 또는 REM 수면으로 평가합니다. 각 웨이브에 대한 게인 컨트롤을 사용하여 각 상태를 더 쉽게 구별할 수 있습니다.

8. 각성 잠복기까지의 NREM 수면을 측정하려면 40초 동안 안정적인 NREM 수면 또는 30초 동안 안정적인 REM 수면을 관찰한 다음 광자극을 위한 패턴 발생기의 스위치를 켭니다(이 프로토콜은 20초 동안 10ms 광 펄스의 20Hz를 생성합니다). 이식된 광섬유에 대한 레이저 방출을 확인합니다.

9. 수면 상태가 각성으로 바뀔 때까지 EEG/EMG 신호를 기록합니다. 두 번 이상의 실험 시험이 필요한 경우 광자극은 수면/각성 구조에 영향을 미칠 수 있는 인위적인 개입이므로 광유전학적 조작을 하루에 한 번으로 제한하십시오.

10. 실험 후 면역조직화학적 분석을 위해 전체 뇌를 샘플링하기 위해 멸균 식염수와 파라포름알데히드(PFA)로 깊은 마취 및 관류합니다.

그림 1: AAV 주입, 시관 섬유 이식 및 EEG/EMG 임플란트 절차. (A) 바이러스 주입의 실험 절차. Cre 재조합효소에 의해 전사가 활성화되는 AAV 벡터에 통합된 EYFP-융합 ChR2 또는 EYFP(대조군용) 유전자를 BNST에 양측으로 주입했습니다. (B) 전극과의 충돌을 방지하기 위해 광섬유를 BNST를 향해 수평에 대해 30° 각도로 삽입했습니다. 그 주위에 두 개의 나사가 삽입되었습니다. (C) 광섬유를 안전하게 배치한 후 EEG/EMG 기록 장치를 이식했습니다. (D) 수술이 끝나면 수술 부위 전체를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮고 강하게 고정해야 합니다. 전극과 페룰을 연결하는 부위에 약제를 바르지 않도록 하십시오.

그림 2: 맞춤형 EEG/EMG 전극 및 전극 핀 삽입 부위. (ᅡ) 상단: 6개의 전극 핀 중 외부 2개의 핀이 2mm로 절단됩니다. 하단: EEG/EMG 전극. (B) 그런 다음 이러한 전극과 EMG 전도선을 납땜합니다. 연결 영역은 시아노아크릴레이트 접착제와 같은 단열재로 격리되어야 합니다. 전극의 삽입 부위는 브레그마(전후 ± 1.5mm, 내외측 ± 1.0mm)에 상대적입니다. EMG 와이어는 삽입 부위(1mm)에서 와이어를 보호하는 절연체를 제거하여 목 근육 아래에 삽입됩니다.