쥐에게 만성적으로 이식된 말초 신경 커프 전극을 통한 미주 신경 자극

초록

출처: Sanchez, CA, et al. 쥐의 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비. J. Vis. 경험. (2020).

이 비디오는 깨어 있는 쥐의 미주 신경 자극을 보여줍니다. 만성 말초 신경 커프 전극을 이식하고 레버 누르기 작업을 훈련받은 쥐는 이식된 헤드 캡을 통해 자극 발생기에 연결됩니다. 미주 신경은 레버를 성공적으로 누를 때마다 즉시 자극되어 운동 지도가 확장됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 커프 전극 제작 자극

1. 커프 튜브를 준비합니다.
   1. 면도날을 사용하여 길이 2.5mm의 폴리머 튜브 조각을 자릅니다. 집게, 끝 또는 종이 클립을 튜브를 통해 삽입하고 칼날을 사용하여 커프 한쪽에 있는 튜브 벽을 세로로 슬릿합니다.
   2. 튜브에서 집게를 제거하고 커프의 정중선을 통해 장축에 수직인 큰 재봉 바늘을 삽입합니다. 슬릿(상단)을 통해 바늘을 반대쪽 튜브 중앙(하단)에 삽입합니다. 바늘을 폼 보드에 넣어 나머지 조립 단계에서 커프를 제자리에 고정합니다.
2. 이식하는 동안 커프 폐쇄를 고정하기 위해 봉합사를 배치합니다.
   작은
   1. 재봉 바늘을 커프 벽을 통해 한쪽 상단 슬릿에서 약 0.5mm 떨어진 정중선에 삽입합니다. 커프 튜브가 손상되지 않도록 바늘을 내부에서 외부로 삽입합니다. 바늘 구멍을 통해 2cm 길이의 6/0 봉합사를 삽입하고 튜브 벽을 통해 바늘을 당겨 봉합사를 커프에 끼웁니다.
   2. 실을 제자리에 두고 바늘을 제거하고 커프의 정중선을 따라 첫 번째 구멍 아래 약 0.5mm 튜브 벽을 통해 두 번째 구멍을 뚫습니다. 바늘 구멍을 통해 봉합사를 삽입하고 튜브 벽을 통해 바늘을 당겨 커프를 통해 봉합사를 다시 끼웁니다.
   봉
   3. 합사의 양쪽 끝은 이제 커프의 바깥쪽에 있어야 합니다. 상단 구멍에서 ~1.5cm, 하단 구멍에서 ~0.5mm가 확장되도록 봉합사를 조정합니다.
   4. 아래쪽 구멍에서 뻗어 있는 봉합사의 짧은 끝에 소량의 UV(자외선) 경화 접착제를 바르고 아래쪽 꼬리가 튜브의 외벽과 거의 같은 높이가 될 때까지 긴 봉합사 끝을 당깁니다. UV 봉을 사용하여 접착제를 경화시키고 봉합사를 제자리에 단단히 고정합니다.
   5. 커프의 반대쪽에서 1.2.1-1.2.3단계를 반복합니다.
3. 백금:이리듐(Pt:Ir) 와이어 리드를 배치합니다.
   1. 작은 재봉바늘을 사용하여 커프 벽에 4개의 구멍을 뚫습니다. 각 구멍 쌍은 수직 정중선에서 약 0.5-0.8mm 떨어진 곳에 배치해야 하며, 커프 양쪽의 상단 슬릿에서 약 0.5-0.8mm 떨어진 곳에 구멍을 뚫어야 합니다.
      주의: 리드를 가장 일관되고 정확하게 배치하려면 바늘을 내부에서 외부로 삽입하여 모든 구멍을 만듭니다. 봉합사 배치를 가이드로 사용합니다.
   재
   2. 봉바늘을 다시 삽입하고 이번에는 리드 구멍 1을 통해 외부에서 내부로 작업합니다. 바늘 눈귀를 통해 7.5cm 길이의 Pt:Ir 와이어 중 약 0.5cm를 삽입하고 튜브를 통해 바늘을 당겨 커프 벽을 통해 와이어 리드를 끼웁니다. 커프의 바깥쪽에서 ~4.5cm가 확장되도록 와이어를 조정합니다(그림 1A).
   3. 리드 구멍 1을 통해 바늘을 다시 삽입하고 다시 외부에서 내부로 작업하고 리드 구멍 2 바로 맞은편에 있는 리드 구멍 1을 통해 바늘을 추가로 삽입합니다. 바늘 눈귀를 통해 Pt:Ir 와이어의 짧은(내부) 끝 ~0.5cm를 삽입하고 튜브를 통해 바늘을 당겨 커프 벽을 통해 와이어 리드를 끼웁니다.
      알림: 이제 Pt:Ir 와이어의 양쪽 끝이 커프의 바깥쪽에 있어야 하며 슬릿 가장자리 주위와 리드 구멍 1을 통해 와이어 루프가 형성됩니다(그림 1B).
   4. 1.3.1-1.3.3단계를 반복하여 리드 구멍 3과 4를 통해 Pt:Ir 와이어를 배치합니다.
   5. 부탄 라이터를 사용하여 리드 구멍 5 및 리드 구멍 6에서 연장되는 Pt:Ir 와이어 끝에서 2-4.
      길이의 절연체를 조심스럽게 제거합니다. 주의: 커프가 손상되지 않도록 리드의 끝을 커프 어셈블리의 나머지 부분에서 조심스럽게 분리하십시오. 부상을 방지하기 위해 도구를 사용하여 전선을 잡으십시오.
   6. 커프 내부의 노출된 와이어를 정렬하여 리드를 최종 위치에 배치합니다. 이렇게 하려면 와이어의 절연되지 않은 부분이 구멍 1과 같은 높이가 될 때까지 구멍 1에서 연장되는 Pt:Ir 와이어의 끝을 부드럽게 당깁니다. 다른 리드로 반복하여 리드 구멍 3과 4를 통해 끼워진 와이어의 절연되지 않은 끝을 정렬합니다.
   7. 리드 구멍 1과 3의 커프 바깥쪽에 있는 와이어 루프에 소량의 UV 경화 접착제를 도포합니다. UV 봉을 사용하여 접착제를 경화시키고 리드를 제자리에 고정합니다.
   8. 작은 피펫 팁을 사용하여 절연되지 않은 Pt:Ir 와이어 리드를 커프의 내벽에 밀어 넣습니다. 리드가 제자리에 있으면 리드 구멍 2와 4에서 연장되는 와이어의 끝을 잘라 약 1mm의 와이어가 커프 벽 외부를 넘어 확장되도록 합니다.
   9. 와이어의 1mm 꼬리를 커프의 외부 표면에 대해 평평하게 접고 함께 짧아지지 않도록 주의합니다. 소량의 UV 경화 접착제를 도포하여 두 꼬리만 덮고 접착제를 경화시켜 리드 배치를 고정하고 전기 절연을 제공합니다.
      주의: 외부에 노출된 Pt:Ir 표면을 접착제로 완전히 덮어 전선을 절연하고 표적을 벗어난 자극을 피하는 것이 중요합니다.
4. 봉합사 고정으로 Pt:Ir 와이어 리드를 제자리에 고정합니다.
   1. 폼 보드에서 커프 어셈블리가 있는 큰 바늘을 제거합니다. 바늘 구멍을 통해 3cm 길이의 6/0 봉합사를 삽입하고 튜브를 통해 바늘을 당겨 중간 지점에서 커프 바닥을 통해 봉합사를 끼웁니다.
   2. 작은 재봉 바늘로 전환하여 Pt:Ir 리드 고정을 위한 봉합사 나사 끼우기를 완료합니다. 동일한 정중선 구멍을 통해 바늘을 삽입하고 튜브와 와이어 리드의 변형을 방지하기 위해 내부에서 외부로 다시 작업합니다. 바늘 눈을 통해 봉합사의 바깥쪽 꼬리를 삽입하고 커프 벽을 통해 바늘을 당겨 커프 가장자리 주위에 봉합사 고리를 만듭니다(그림 1C).
      참고: 집게를 사용하고 현미경으로 작업하여 봉합사가 커프의 장축을 따라 방향이 잡히고 튜브에 평평하게 놓이도록 합니다. 이 단계는 리드가 커프 안쪽에서 분리된 상태로 유지되고 커프 정중선 측면에 고정되도록 합니다.
   3. 커프의 바깥쪽에 봉합사의 끝을 반 매듭으로 묶어 커프의 반대쪽 끝 주위에 두 번째 루프를 만듭니다. 봉합사가 커프의 장축을 따라 흐르고 튜브에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 매듭이 튜브에 평평하게 놓이도록 단단히 잡은 상태에서 소량의 UV 경화 접착제를 반매듭에 바르고 경화하여 제자리에 고정합니다.
   4. 봉합사의 끝을 가능한 한 매듭에 가깝게 조심스럽게 자릅니다. 필요한 경우 소량의 추가 UV 경화 접착제를 사용하여 봉합사의 짧은 끝을 접착하여 튜브에 평평하게 놓이도록 합니다(그림 1D).
5. 커넥터 핀을 Pt:Ir 와이어 리드에 납땜합니다.
   1. 부탄 라이터를 사용하여 각 Pt:Ir 와이어 리드 끝에서 ~3mm에서 절연체를 제거합니다. 금 핀의 컵 쪽( 재료 표 참조)을 각 리드의 절연되지 않은 끝에 납땜합니다.
6. 조립된 장치의 임피던스를 테스트합니다.
   금
   1. 색 핀을 LCR(인덕턴스(L), 커패시턴스(C) 및 저항(R)) 미터 또는 전극 임피던스 검사 모듈의 입력에 연결하고 테스트 주파수를 1kHz로 설정합니다. 커프 튜브(및 커프 내부의 Pt:Ir 자극 접점)를 식염수로 채워진 작은 비커에 담그고 금색 리드 핀과 프로브 커넥터를 건조하게 유지하도록 주의합니다. 이식을 진행하기 전에 조립된 커프의 1kHz에서 임피던스가 2kΩ 미만인지 확인하십시오.
      참고: 임피던스가 높다는 것은 종종 노출된 Pt:Ir 표면적이 부적절함을 나타내며, 이는 절연체 제거 부족, 커프 내부에 접착제의 우발적인 도포, 끊어진 와이어 가닥, 등. 또한 장기간 사용하면 접점이 단락될 수 있는 와이어 가닥이 파손되거나 잘못 배치되지 않았는지 커프에 검사해야 합니다.

2. 헤드캡 구성

참고: 헤드캡 조립 절차는 이전에 게시된 절차와 유사하며 편의를 위해 여기에 요약되어 있습니다.

1. 헤드캡을 조립합니다
   길이
   1. ~13mm, 길이 1~10mm의 30AWG(American Wire Gauge) 와이어 랩 조각 두 개를 자릅니다. 양쪽 전선의 양쪽 끝에서 ~1.5mm의 절연체를 벗겨냅니다. 금색 핀의 핀 쪽을 컵에 최대한 가깝게 각 와이어의 한쪽 끝에 납품합니다. 와이어 커터를 사용하여 솔더 조인트 너머의 과도한 핀 길이를 잘라냅니다.
   2. AWG 와이어의 다른 쪽 끝을 4핀 마이크로스트립 커넥터의 두 중앙 납땜 컵에 납품합니다.
   3. 와이어 헤드캡 리드를 커넥터 쪽으로 구부리고 그림 2A와 같이 금색 핀을 커넥터에 평평하게 놓습니다. 짧은 와이어에 연결된 핀은 더 긴 와이어에 연결된 핀 아래에 배치해야 합니다. 네일 아크릴, 치과용 시멘트 또는 UV 경화 접착제를 사용하여 헤드캡 리드를 제자리에 고정합니다.

3. 장치 사용

1. 만성 미주 신경 자극을 위해 커프 전극을 이식합니다.
   참고: 모든 수술 절차는 NIH(National Institutes of Health) 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침 및 현지 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 승인에 따라 적절한 마취 하에 멸균 또는 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 다음 절차는 장치의 대표적인 사용법을 설명하기 위한 것이며 포괄적이지 않습니다.
   1. 쥐를 정위 고정 프레임에 넣고 두정골과 후두골 위에 시상 절개를 하여 헤드캡/커넥터 이식을 위한 두개골 표면을 드러냅니다. 두개골에 조심스럽게 구멍 4개를 뚫고 보석상의 나사를 놓습니다. 치과용 아크릴을 사용하여 헤드캡을 두개골과 나사에 고정합니다.
   2. 정위 프레임에서 쥐를 제거하고 오른쪽에 눕힙니다. 목 왼쪽 피부를 수직으로 절개하고 흉골유돌근과 흉골설골근 사이, 오모설골근 아래에 위치한 경동맥에서 왼쪽 미주 신경을 조심스럽게 절개합니다.
   3. 커프가 두개골 쪽으로 피하로 이어지는 터널을 뚫습니다. 금색 핀을 사용하여 리드를 헤드캡에 연결합니다.
   4. 미주 신경을 커프 내부에 넣고 커프 봉합사에 이중 매듭을 묶어 장치를 닫았습니다. 무딘 비전도성 갈고리로 신경을 조작하거나 신경을 둘러싼 결합 조직을 잡아 이식 중 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오.
   5. 장치에 자극을 가하여 임플란트를 테스트합니다(0.8mA, 30Hz, 100μs 이상 펄스의 10초 트레인). 적절한 이식은 호흡을 멈추고 SpO₂(말초 모세혈관 산소 포화도)가 5% 이상 떨어집니다.
   6. 금핀과 노출된 리드를 치과용 아크릴로 덮고 봉합사로 상처를 봉합한 다음 절개 부위를 식염수, 알코올 및 포비돈-요오드 용액으로 청소합니다.
   7. NIH 지침 및 IACUC 승인에 따라 대체 수액, 진통제 및 수술 후 관리를 제공합니다.
2. 깨어 있는 행동 중에 미주 신경을 자극합니다.
   참고: 동물이 특정 운동 작업을 수행할 때 VNS(미주 신경 자극)를 전달하면 이전에 작업 관련 근육 조직의 운동 지도 표현을 확장하는 것으로 나타났습니다. 우리는 이 검증된 패러다임을 사용하여 장치 사용의 대표적인 예를 제공하지만 다른 많은 행동 패러다임 및/또는 자극 매개변수는 대체 애플리케이션과 관련이 있을 수 있습니다. 쥐는 장치를 이식하기 전에 여기에 사용되는 레버 프레스 작업에 능숙하도록 훈련되었습니다. 수술 후, VNS 전달 전에 우수한 성능이 다시 확인되었습니다: 쥐는 하루에 두 번의 30분 훈련 세션에서 최소 100회의 성공적인 시도를 수행했습니다. VNS는 5일 동안 10번의 후속 교육 세션 동안 올바른 레버 누르기와 짝을 이루었습니다.
   1. 이식된 헤드캡을 통해 쥐를 자극 발생기에 연결하고 적절한 자극 설정으로 조정합니다. VNS에 의해 유도된 운동 피질 맵의 재구성을 위해, 각각의 올바른 레버 프레스를 각각 너비 100μs, 진폭 800μA의 15 위상 펄스의 단일 트레인과 짝을 이루고 30Hz의 주파수로 전달됩니다.
   2. 자극 트레인은 10번의 30분 훈련 세션 동안 각 성공적인 레버 누름을 감지한 직후 전달됩니다. VNS 전달 중에 오실로스코프를 사용하여 전류 자극의 성공적인 전달을 모니터링합니다.
3. 만성적으로 이식된 커프 기능을 검증합니다.
   1. 마지막 VNS 쌍 훈련 세션의 24시간 이내에 두개내 미세 자극(ICMS)을 사용하여 운동 피질의 기능적 체성 지도를 정량화합니다.
   2. 운동 피질의 ICMS 매핑을 위한 마취 유도 후, 30Hz, 0.8mA 전류 자극(100μs 이상 펄스)의 10초 트레인을 적용하여 커프 기능을 다시 검증하면 호흡이 중단되고 SpO₂ 수치가 감소해야 합니다.
      참고: 응용 분야에 따라 5% 미만의 신뢰할 수 있는 SpO₂ 강하가 관찰되거나 더 높은 전류 진폭(최대 1.6mA)이 SpO₂에서 최소 5% 감소를 안정적으로 생성하는 경우 커프 기능이 허용되는 것으로 간주될 수 있습니다. 호흡 정지 및/또는 SpO₂의 신뢰할 수 있는 감소를 관찰하지 못하는 것은 임플란트 실패를 나타냅니다.

결과

그림 1: 자극 커프 전극의 조립. (A) 커프의 양쪽에 봉합사를 고정한 후 재봉바늘을 사용하여 구멍 #1(흰색 화살촉)의 커프 벽을 통해 Pt:Ir 와이어를 끼울 수 있습니다. (B) Pt:Ir 와이어는 커프 가장자리 주위에 와이어 루프를 만들고 구멍 #1(흰색 화살촉)을 통해 와이어를 다시 끼우고 커프 관통 구멍 #2(노란색 화살촉)를 가로질러 스레드를 한 후 적절하게 나사산이 있고 절연 제거 준비가 되어 있습니다. (C) 두...

재료